摘要
目的：SELEX（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment）技术筛选辐射敏感蛋白PIG3特异性适配体并结合电化学阻抗谱（EIS）构建适配体EIS生物传感器，实现对辐射敏感蛋白PIG3的快速、便携检测，从而建立辐射剂量评估的新方法，辅助急性放射病的快速诊断。 方法：设计合成含30个随机碱基的单链DNA（ssDNA）适配体筛选文库，微孔板SELEX法进行PIG3蛋白的筛选。通过偶数轮增加反向筛选，避免ssDNA的非特异性结合。对结合序列进行不等长扩增，并用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶分离两条ssDNA单链，纯化后作为次级文库。通过对比每轮筛选后PCR扩增的循环数是否前移，监测每轮文库的富集情况。对已富集文库进行高通量测序以获得高频序列，利用RNAstructureVersion5.7对这些序列的二级结构进行预测，并比较各序列对PIG3蛋白的结合力，选取结合力高并且特异性强的ssDNA序列作为PIG3蛋白的特异性适配体。比较适配体及其不同程度截短序列的结合力来判断适配体的识别功能区。生物膜层干涉技术（BLI）计算适配体的解离常数（Kd），以鉴定适配体对PIG3蛋白的亲和力。建立双适配体夹心法检测PIG3蛋白，确定检测下限。将前述Kd值较低的适配体进行巯基修饰，固定于金电极表面，对不同浓度梯度PIG3蛋白进行EIS检测，以此确定适配体EIS生物传感器的灵敏度，并与双适配体夹心法的检测下限进行比较。 结果：经过7轮筛选，获得了富集次级文库。对富集文库高通量测序后，对富集序列的二级结构进行预测，通过序列结合域分析选取适配体序列：G1、G6、G11、G12、G16、G9、G13、G15、G18进行结合力和特异性的鉴定，获得了相对结合力最强的PIG3特异性适配体G9和G15。通过对G9、G15序列二级结构拆分和搭接，设计合成其截短序列，确定其关键结构域的序列组成。最终确定G9和G15的全长序列是构成识别的关键结构折叠序列。通过生物层干涉法（BLI）检测到的G9和G15的解离常数为Kd，G9=1.41nM和Kd，G15=5.62nM。建立了PIG3蛋白的双适配体夹心法，线性检测范围1-10ng/μL，检测限（LOD）=1ng/μL。对亲和力最高的G9进行巯基修饰使其可以固定在金电极表面，进行Spacer18修饰使其在金电极表面可以均匀分布。计时库伦法确定适配体在金电极表面的最大吸附量为1μM，电化学阻抗谱检测不同浓度梯度的PIG3与P4HB（对照蛋白），确定适配体-EIS生物传感器的LOD为10pg/μL，低于先前建立的ELONA检测方法的检测下限，灵敏度提升了100倍，并且可以实现在7min内对单个样品进行快速检测。 结论：采用微孔板SELEX法筛选出放射敏感蛋白PIG3的特异性适体G9和G15，建立了PIG3（LOD=1ng/μL）的双适体夹心检测法。同时，构建了一种基于适配体结合电阻抗的生物传感器，并实现了对PIG3蛋白的高灵敏度（LOD=10pg/μL）和快速（7min）检测。
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