摘要
研究背景：穿透支原体（Mycoplasmapenetrans,Mpe）是一种首次从人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者的尿液中分离到的支原体。这种支原体具有独特的细长烧瓶状形态和尖形结构，体内外试验都证实其具有入侵细胞的能力。Mpe与宿主靶细胞之间的黏附主要由脂质相关膜蛋白（LAMP），特别是暴露在细胞表面的P35脂蛋白介导。P35脂蛋白是一种免疫优势抗原，是Mpe感染血清学诊断的主要候选抗原。因此，P35脂蛋白在Mpe感染和黏附宿主的过程中发挥着重要作用。然而，对P35脂蛋白的受体蛋白和其结合功能域的研究目前还甚少。本研究旨在筛选出Mpe-P35在人尿道上皮细胞（SV-HUC-1细胞）膜上的受体蛋白并鉴定其与受体蛋白之间的相互作用及其结合功能域。 研究目的：筛选出Mpe-P35在SV-HUC-1细胞膜上的受体蛋白，鉴定Mpe-P35与受体蛋白之间的相互作用及其结合功能域，以阐明Mpe经P35黏附和入侵宿主细胞的机制，为有效预防和治疗Mpe感染奠定实验基础。 研究方法： 1.P35重组蛋白的表达与纯化：原核表达纯化含P35（蛋白ID：AAC16392.1）全部氨基酸的重组蛋白P35（rP35），超滤浓缩后用BCA法测定rP35的浓度； 2.兔源性rP35抗体的制备与纯化：将rP35与弗氏佐剂混合，对新西兰兔进行免疫。免疫4次后收集兔血清，免疫球蛋白部分经连续硫酸铵沉淀法粗提纯，然后经溴化氰活化的琼脂糖4B偶联和洗脱对rP35特异的抗体进行纯化； 3.间接免疫荧光试验检测rP35和Mpe黏附SV-HUC-1细胞的情况以及rP35抗体能否抑制Mpe对SV-HUC-1细胞的黏附； 4.利用改进的VOPBA技术和HPLC-MS分析SV-HUC-1细胞膜中可能与rP35发生特异结合的受体蛋白，用Westernblotting进行鉴定，并通过间接免疫荧光观察其在SV-HUC-1细胞中的定位情况； 5.通过Far-westernblotting、间接ELISA、免疫共沉淀和免疫荧光共定位4种独立的实验方法检测γ-肌动蛋白（ACTG1）和角蛋白8（KTR8）是否与rP35蛋白发生相互作用； 6.利用间接免疫荧光观察ACTG1对rP35和Mpe黏附SV-HUC-1细胞的影响； 7.为了进一步验证SV-HUC-1细胞上ACTG1蛋白的表达水平是否会影响rP35和Mpe对SV-HUC-1细胞的黏附，将细胞转染ACTG1-siRNA后，再分别使用rP35和Mpe处理细胞，间接免疫荧光观察rP35和Mpe对SV-HUC-1细胞的黏附量的改变； 8.为了验证重组蛋白P35与ACTG1蛋白的主要结合功能域，合成5条可能与结合相关的截短的P35多肽，采用间接ELISA和Far-westernblotting检测ACTG1与合成多肽的结合情况。利用间接免疫荧光检测合成肽对rP35与SV-HUC-1细胞黏附的影响。 研究结果： 1.SDS-PAGE及Westernblotting的结果表明成功表达和纯化重组P35蛋白，经BCA试剂盒检测，超滤后rP35蛋白浓度可达1.8mg/mL； 2.成功制备和纯化兔源rP35多克隆抗体，免疫4次后其抗体效价可达1:2560000； 3.间接免疫荧光试验的结果表明rP35和Mpe都可黏附在SV-HUC-1细胞上；rP35抗体能部分抑制Mpe对SV-HUC-1细胞的黏附； 4.经改进的VOPBA技术和HPLC-MS分析，SV-HUC-1细胞膜中与rP35发生特异性结合的受体蛋白最可能是分子量为42kDa的ACTG1蛋白和分子量为53kDa的KRT8蛋白，ACTG1和KRT8蛋白主要分布在SV-HUC-1细胞的胞质和胞膜上； 5.4种独立的实验表明rP35可以与ACTG1蛋白发生特异性结合，而不与KRT8发生相互作用； 6.ACTG1蛋白预孵育组以及抗ACTG1抗体预孵育组中rP35和Mpe对SV-HUC-1细胞的黏附都有所下降，说明ACTG1蛋白可能与rP35和Mpe对细胞的黏附相关； 7.在ACTG1-siRNA转染的SV-HUC-1细胞中ACTG1的表达明显下降，rP35和Mpe对细胞的黏附量也明显减少，表明ACTG1在rP35和Mpe对SV-HUC-1细胞的黏附过程中发挥着不可或缺的作用； 8.成功合成5条可能与结合相关的截短的rP35多肽和对照肽。间接ELISA结果表明，ACTG1能够与截短多肽rP35-1和rP35-4在体外发生特异结合，与rP35-2、rP35-3、rP35-5以及对照多肽不能特异结合；Far-westernblotting结果表明ACTG1能够与截短多肽rP35-4在体外发生特异结合，与其他多肽以及对照多肽不能发生特异结合；间接免疫荧光结果表明rP35对rP35-1预孵育后的SV-HUC-1细胞的黏附相对减少，对rP35-4预孵育后的SV-HUC-1细胞的黏附明显减少。 结论 1.ACTG1是Mpe-P35脂蛋白在SV-HUC-1细胞上的黏附受体。 2.Mpe-P35脂蛋白第35-42和179-186氨基酸是Mpe-P35与ACTG1发生特异结合的结合功能域。
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