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GPR91介导血管内皮细胞焦亡促动脉粥样硬化及其作用机制

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【背景】最近的研究发现，三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle,TCA）中间体对动脉粥样硬化的发生和发展起着重要作用。琥珀酸是连接三羧酸循环与线粒体呼吸链的重要桥梁。研究发现，在缺氧、缺血、中毒和高血糖等病理状态下，琥珀酸在线粒体、胞浆及细胞外积聚，并且激活其特异性受体G蛋白偶联受体91（Gproteincoupledreceptor91,GPR91），从而影响细胞的多个生物学过程。本课题组之前的研究表明琥珀酸蓄积上调血管内皮细胞（Endothelialcells，ECs）GPR91的表达并诱导ECs焦亡，血管内皮细胞焦亡与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。在此基础上，我们将在动物水平探讨GPR91与动脉粥样硬化病变间的关系并从细胞学水平探讨其作用机制。 【目的】探讨GPR91对动脉粥样硬化的影响及其作用机制。 【方法】1.首先从细胞水平观察过表达GPR91对体外培养人脐静脉内皮细胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVECs）焦亡相关蛋白表达的影响。将培养的HUVECs分为control组、GPR91LV组（慢病毒转染构建GPR91过表达HUVECs）、LVcon组。通过Westernblotting检测GPR91过表达对HUVECs对焦亡相关蛋白以及炎症因子表达的影响。2.GPR91shRNA慢病毒转染构建GPR91敲低HUVECs，将HUVECs分为control组、GPR91sh组（慢病毒转染构建GPR91shRNAHUVECs）、shcon组，Westernblotting检测HUVECs焦亡相关蛋白以及炎症因子表达的影响。3.构建血管内皮细胞特异性GPR91shRNA慢病毒，尾静脉注射高脂饮食喂养apoE-/-小鼠，从整体动物水平上观察AS病变与GPR91间的关系。实验分组如下:control组、GPR91sh组、shcon组，均给予高脂饮食。12周后，处死小鼠，HE染色、油红O染色检测三组小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块及脂质蓄积，Image-proplus图像分析软件分析计算主动脉根部斑块面积，Westernblotting观察血管壁焦亡相关蛋白表达的变化。转录组学探讨GPR91过表达影响血管内皮细胞焦亡的分子机制。 【结果】1.Westernblotting结果显示GPR91LVcon对NLRP3、VCAM-1、ICAM-1、GSDMD-N、Caspase-1、IL-18、IL-1β焦亡相关蛋白表达无明显影响。GPR91LV上调了NLRP3、VCAM-1、ICAM-1、GSDMD-N、Caspase-1、IL-18、IL-1β焦亡相关蛋白的表达（P＜0.05）。2.control组和GPR91shcon组NLRP3、VCAM-1、ICAM-1、GSDMD-N、Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达无明显改变。GPR91shRNA抑制GPR91、NLRP3、VCAM-1、ICAM-1、GSDMD-N、Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达上调（P＜0.05）。3.动物实验结果表明：apoE-/-小鼠高脂饮食12周后GPR91shcon组、control组间动脉粥样硬化病变无明显差异；GPR91shRNA病毒组apoE-/-小鼠与control组以及shcon组相比其TG、TC、LDL-C均明显降低（P＜0.05）。与Control组及GPR91shcon组相比，GPR91sh组小鼠主动脉根部斑块面积减少，动脉粥样硬化病变区域红染脂滴减少。Massson染色检测小鼠主动脉根部动脉粥样硬化病变区域胆固醇结晶沉积，结果表明与Control组及GPR91shcon组相比，GPR91sh组小鼠动脉粥样硬化病变区域胆固醇结晶数目明显减少，表明敲减血管内皮细胞GPR91可降低高脂饮食ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变中的脂质蓄积（P＜0.05）。Westernblotting检测结果显示GPR91sh下调高脂饮食ApoE-/-小鼠主动脉组织GPR91、焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD-N、Caspase-1、IL-18、IL-1β以及炎症因子VCAM-1、ICAM-1的表达（P＜0.05）。与control组相比，GPR91LV明显上调HUVECs中PKC的表达，而GPR91sh明显下调HUVECs中PKC的表达。尾静脉注射GPR91shRNA慢病毒的高脂饮食ApoE-/-小鼠主动脉组织中，PKC含量明显降低（P＜0.05）。4.差异基因统计结果显示，与control组比较，过表达GPR91后筛选出的差异表达基因为169个，其中上调的有55个，下调的有114个。GO功能富集分析结果显示，上调差异基因主要参与生物过程的有信号受体的活性调节、脂多糖翻译的信号通路等；上调差异基因主要参与细胞成分有三级颗粒腔、特定颗粒腔等；上调差异基因参与分子生物学功能的包括受体配体活性、细胞因子活性等。下调差异基因主要参与的生物过程有基因组复制的负调控、病毒生命周期的负调控等；下调差异基因主要参与细胞成分有特异性颗粒、细胞顶端部分等；下调差异基因参与分子生物学功能的包括双链RNA结合、酶抑制剂活性等。KEGG信号通路富集分析结果显示，GPR91过表达后，最显著的前20条通路分别是细胞因子受体相互作用，NOD样受体信号通路，类风湿关节炎，氨基糖和核苷酸糖代谢，IL-17信号通路，细胞质DNA传感途径，病毒蛋白互相作用，趋化因子信号通路，酒精性肝病，糖酵解。 【结论】GPR91可能通过PKC途径激活NLRP3小体介导血管内皮细胞焦亡促进动脉粥样硬化。

李璐

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动脉粥样硬化 特异性受体G蛋白偶联受体91 血管内皮细胞 三羧酸循环 细胞焦亡

硕士

病理学与病理生理学

危当恒

2023

南华大学

中文

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