摘要
心血管疾病（CardioVascularDisease，CVD）在全球范围内是造成残疾和死亡的主要原因之一，而大多数心血管疾病的发生与动脉粥样硬化密切相关。动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症性疾病，主要表现为动脉壁脂质累积、慢性炎症。肠道菌群及其代谢产物不仅影响消化系统疾病，还可能通过代谢依赖性与非代谢依赖性途径影响心血管疾病的发生与发展。本研究通过16SrDNA扩增子测序比较动脉粥样硬化患者与健康对照者粪便中肠道菌群在物种多样性与菌群组成上的差异，并利用粪菌移植（Fecalmicrobiotatransplantation，FMT）技术在ApoE-/-和C57BL/6J小鼠模型中探索肠道菌群在动脉粥样硬化斑块进展中的作用，以期为靶向肠道菌群干预心血管疾病提供实验依据。 目的： 1.利用16SrDNA扩增子测序技术比较动脉粥样硬化患者与对照者之间肠道菌群的物种多样性及群落组成差异。 2.通过将动脉粥样硬化患者或健康对照者粪便悬液中的肠道菌群移植到ApoE-/-、C57BL/6J小鼠中，探讨肠道菌群在动脉粥样硬化斑块、脂质代谢、炎症反应中的作用。 方法： 1.比较动脉粥样硬化患者与对照者肠道菌群的差异。收集医院心内科经冠脉血管造影提示存在动脉粥样硬化的患者的晨便35例，并收集年龄性别相匹配且符合纳入标准的对照者晨便样本32例。提取粪便基因组DNA，扩增16SrDNA(V3+V4)区，再使用IlluminaNovaseq6000进行测序。对测序数据进行生物信息学分析，包括OTU聚类分析、物种注释及分类学分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、组间差异显著性分析等，比较两组间肠道菌群的多样性以及主要差异细菌。 2.采用粪菌移植技术构建小鼠模型。7周龄ApoE-/-小鼠24只，C57BL/6J小鼠10只，分为ApoE-/--FMT-C组、ApoE-/--FMT-D组、C57BL/6J-FMT-C组和C57BL/6J-FMT-D组。其中ApoE-/--FMT-C组、ApoE-/--FMT-D组小鼠饲喂高脂饲料，C57BL/6J-FMT-C组和C57BL/6J-FMT-D组小鼠饲喂正常饲料。从喂养高脂饮食或正常饲料后的第7周开始，在小鼠饮用水中添加广谱抗生素（1g/L氨苄青霉素、0.5g/L盐酸万古霉素、1g/L硫酸新霉素、1g/L甲硝唑），以去除小鼠自身的肠道菌群制造类无菌小鼠状态，持续3周后停止添加抗生素，恢复小鼠正常饮水3天，以去除残留抗生素。随后通过灌胃粪菌悬液的方式，将动脉粥样硬化患者的肠道菌群移植给ApoE-/--FMT-D组和C57BL/6J-FMT-D组小鼠、将对照者的肠道菌群移植给ApoE-/--FMT-C组和C57BL/6J-FMT-C组小鼠，灌胃量为0.4ml/100g，首日灌胃2次，间隔8小时，之后每隔1天灌胃一次，持续1周，随后各组继续喂养8周。 3.评估肠道菌群移植对动脉粥样硬化的作用。在饲养结束后，乙醚麻醉小鼠，于心脏处取血，测定血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的水平；取小鼠主动脉，根据主动脉根部横截面切片油红O染色评估动脉粥样硬化斑块的大小；主动脉大体油红O染色评估动脉粥样硬化斑块的覆盖面积；免疫组织化学比较ICAM-1、VCAM-1、CD36、IL-6、IL-10等蛋白的表达情况。 结果： 1.动脉粥样硬化患者与对照者的肠道菌群谱存在差异 对16SrDNA扩增子测序所得序列进行聚类、OTU分析发现，与对照组相比，病例组中所含OTU的数量更高（P＜0.05）；在不同分类学水平上统计了物种丰度前十的细菌，在门水平上，对照组与病例组厚壁菌门丰度分别为49.93%与56.25%，拟杆菌门丰度分别为39.57%与33.98%，但差异均无统计学意义；与对照组相比，病例组中蓝细菌门（Cyanobacteria）显著降低（0.031%vs.0.003%，P=0.003），Patescibacteria显著升高（0.013%vs.0.022%，P=0.044）；在属水平上，与对照组相比，病例组巨单胞菌属（Megamonas）水平显著升高（1.11%vs.6.45%,P=0.042）。Metastats分析比较了两组间有统计学差异的群落，两组间有差异的菌群在门水平上有2种，纲水平上有2种，目水平上有5种，科水平上有5种，属水平上有18种。Alpha多样性分析结果显示，ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数在两组间的差异均无统计学意义；Beta多样性分析结果表明病例组与对照组肠道菌群组成差异显著（Anosim,P＜0.01）。LEfSe分析显示对两组间差异贡献较大的群落在对照组中为放线菌门（p_Actinobacteria），放线菌纲（c_Actinobacteria）双歧杆菌科（f_Bifidobacteriaceae），双歧杆菌目（o_Bifidobacteriales）和双歧杆菌属（g_Bifidobacterium），病例组中则为巨单胞菌属（g_Megamonas）。 2.成功构建不同组来源的肠道菌群动脉粥样硬化小鼠模型 采用灌胃粪菌悬液的方式移植动脉粥样硬化患者或对照者的肠道菌群到小鼠体内，建立人来源肠道菌群小鼠模型。在菌群移植8周后，发现与ApoE-/--FMT-C组相比，ApoE-/--FMT-D组小鼠体重增加速度缓慢。 3.移植不同来源的肠道菌群对小鼠动脉粥样硬化的作用 小鼠主动脉根部横截面油红O染色结果发现，与ApoE-/--FMT-C组相比，ApoE-/--FMT-D组的小鼠斑块浸润厚度增加（P＜0.05）；主动脉大体染色结果提示，与ApoE-/--FMT-C组相比，ApoE-/--FMT-D组小鼠动脉粥样硬化斑块覆盖面积增高（P＜0.05）；两组间血清血脂四项差异不具有统计学意义；免疫组织化学结果表明，与ApoE-/--FMT-C组相比，ApoE-/--FMT-D组小鼠中CD36、IL-6表达升高（P＜0.05），IL-10表达下降（P＜0.05）；与C57BL/6J-FMT-C组相比，C57BL/6J-FMT-D组中IL-10下降（P＜0.05）。 结论： 1.动脉粥样硬化患者与对照者肠道菌群的菌群组成谱存在差异，两组间差异较大的菌为放线菌门、放线菌纲、双歧杆菌科、双歧杆菌目、双歧杆菌属和巨单胞菌属。 2.来源于动脉粥样硬化患者的肠道菌群能促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成，可能与炎性细胞因子的释放有关。
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