摘要
第一部分利拉鲁肽对高糖高脂诱导心肌细胞损伤的保护作用 研究背景与目的:糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一种复杂的代谢紊乱综合征,胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)与分泌不足可引起糖脂代谢紊乱，并继发多种大血管与微血管损害。既往研究表明新型降糖药物利拉鲁肽的心血管保护作用可能与其抗炎、抗纤维化、改善脂质代谢等有关。我们前期研究发现利拉鲁肽能够显著改善糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)大鼠的血脂谱并减轻心肌损伤，进而发挥心脏保护作用。尽管如此，利拉鲁肽抑制心肌细胞损伤的具体机制尚未完全阐明。本研究通过建立高糖高脂诱导的心肌细胞损伤模型，旨在探讨利拉鲁肽对心肌损伤的保护作用及其相关分子机制，以期为利拉鲁肽在临床治疗中带来的心血管获益作用提供一定的实验依据。 研究方法:分别使用不同浓度葡萄糖(5.5、10、25、30、50mM)刺激大鼠乳鼠原代心肌细胞24h,CCK8法检测细胞存活率，确定本实验中诱导心肌细胞损伤所需的高糖浓度;随后，HG联合不同浓度棕榈酸(palmiticacid,PA)(100、250、500、1000μM)刺激心肌细胞24h,CCK8法检测细胞存活率，确定本实验中诱导心肌细胞损伤所需的高脂浓度;最后，不同浓度利拉鲁肽(50、100、200、300、400、500nM)处理高糖高脂刺激的心肌细胞24h,CCK8法检测细胞存活率，确定本实验中利拉鲁肽处理浓度。后续实验分为4组:正常组(control,Con)、高糖高脂组(highglucoseandhighfat,HG+PA)、利拉鲁肽组(liraglutide,Lira)、AMPK抑制剂组(CompoundC)。通过CellularROS染色检测细胞ROS含量、JC-1染色检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化、Westernblot方法检测呼吸链相关蛋白(NDUFB8、UQCR2、SDHB、MTCO2、ATP5A1)表达和化学发光法检测细胞ATP含量明确利拉鲁肽对损伤细胞线粒体功能障碍的作用;通过Mito-TrackerRed染色观察利拉鲁肽对损伤细胞线粒体形态的改变;通过荧光法检测细胞心磷脂含量评估利拉鲁肽对损伤细胞线粒体特有磷脂含量的影响;通过Westernblot方法检测利拉鲁肽对损伤细胞线粒体动力学相关蛋白(MFN1、MFN2、OPA1、DRP1、FIS1)、细胞凋亡相关蛋白(Caspase3、Cleaved-caspase3、cytochromeC)表达的影响;通过Westernblot方法检测线粒体自噬相关蛋白及信号通路蛋白(PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、AMPKα、p-AMPKα)的表达以及Mito-TrackerRed与Lyso-TrackerGreen染色明确利拉鲁肽对损伤细胞线粒体自噬的作用。随后，通过TUNEL染色和Westernblot方法检测AMPK抑制剂CompoundC对细胞凋亡及相关蛋白(Caspase3、Cleaved-caspase3、cytochromeC)表达的影响;通过Westernblot方法检测Parkin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、FIS1蛋白表达以及Mito-TrackerRed与Lyso-TrackerGreen染色明确CompoundC对线粒体自噬的影响，同时，通过免疫荧光检测CompoundC对FIS1表达的影响。 研究结果:本研究以25mM葡萄糖+250μM棕榈酸作为心肌细胞高糖高脂损伤模型的实验处理浓度，200nM为利拉鲁肽实验处理浓度。与Con组相比，HG+PA组细胞ROS含量显著增加，线粒体膜电位显著下降，呼吸链相关蛋白NDUFB8、UQCR2、SDHB、MTCO2、ATP5A1表达显著减少，细胞ATP含量显著减少，线粒体片段化现象显著增加，线粒体动力学相关蛋白FIS1表达显著减少，细胞心磷脂含量显著下降，细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、细胞质cytochromeC表达显著增加、线粒体cytochromeC表达显著减少，线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著减少，线粒体与溶酶体共定位减少，信号通路蛋白p-AMPKα表达显著减少;与HG+PA组相比，Lira组细胞ROS含量显著降低，线粒体膜电位显著升高，呼吸链相关蛋白NDUFB8、UQCR2、SDHB、MTCO2、ATP5A1表达显著增加，细胞ATP含量显著增加，线粒体片段化现象显著减少，线粒体动力学相关蛋白FIS1表达显著增加、细胞心磷脂含量显著升高，细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、细胞质cytochromeC表达显著减少，线粒体cytochromeC表达显著增加，线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著增加，线粒体与溶酶体共定位增加，信号通路蛋白p-AMPKα表达显著增加;与Lira组相比，CompoundC组线粒体动力学相关蛋白FIS1表达显著减少，FIS1蛋白免疫荧光强度显著减少，线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著减少，线粒体与溶酶体共定位显著减少，细细胞凋亡显著增加，细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、细胞质cytochromeC表达显著增加，线粒体cytochromeC表达显著减少。 结论:利拉鲁肽减轻高糖高脂诱导的肌细胞损伤，其保护作用可能与增强AMPK-Parkin通路介导的线粒体自噬，进而减轻心肌细胞凋亡有关。本研究发现了利拉鲁肽通过线粒体自噬改善心肌细胞损伤的分子机制，为阐明利拉鲁肽的心脏保护作用机制提供了有力证据与理论基础。 第二部分高密度脂蛋白颗粒对糖尿病合并冠心病患者心血管事件预测的研究 研究背景与目的:动脉粥样硬化性心血管疾病(atheroscleroticcardiovasculardisease,ASCVD)是引起全球范围内心血管死亡的主要原因之一。2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)是冠心病(cornaryarterydisease,CAD)等ASCVD的独立危险因素。血脂异常是T2DM最显著的代谢特征，通常表现为空腹及餐后甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein,HDL)及高密度脂蛋白胆固醇(HDLcholesterol,HDL-C)降低，低密度脂蛋白(low-densitycholesterol,LDL)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLcholesterol,LDL-C)升高，且小而密LDL颗粒(smalldenseLDL,sdLDL)升高。尽管流行病学研究认为血浆HDL-C浓度与冠心病发病呈负相关，但是多项药物临床实验表明单纯升高HDL-C浓度并不能产生心血管获益，原因之一可能与HDL颗粒的高度异质性相关。近年研究发现，HDL颗粒大小与CAD及T2DM的发病密切相关。然而，不同大小HDL颗粒在T2DM合并CAD患者中的分布特点，及其与心血管事件(cardiovascularenevts,CVEs)的关系尚未完全阐明。本研究旨在探讨T2DM合并SCAD(stablecoronaryarterydisease,SCAD)患者HDL颗粒分布的特点，分析不同大小HDL颗粒与T2DM合并SCAD相关性及其在CVEs中的预测价值。 研究方法:从2012年10月至2018年4月，本研究共纳入了185例SCAD患者和185例T2DM合并SCAD的患者，进行了中位数为37.7个月的随访。收集了每例患者入组的基线特征和实验室检验数据，并记录了随访期间CVEs的发生情况。CVEs定义为不稳定型心绞痛再住院、非致死性心肌梗死、非致死性缺血性脑卒中、冠状动脉支架植入术和/或冠状动脉旁路移植术和心血管死亡。应用Lipoprint脂蛋白分类检测仪对HDL颗粒进行分类检测，将HDL分为三类即大颗粒HDL、中等颗粒HDL及小颗粒HDL。检测结果分别以不同大小颗粒HDL-C的浓度数值以及不同大小颗粒HDL-C浓度占HDL-C总浓度百分比表示。采用Logistic回归模型评估不同大小HDL颗粒与T2DM合并SCAD疾病状态之间的关系。采用Cox回归分析及Kaplan-Meier生存分析评估T2DM合并SCAD患者不同大小HDL颗粒与CVEs的关系。 研究结果:与SCAD组患者相比，T2DM合并SCAD组患者小颗粒HDL-C浓度和小颗粒HDL-C浓度占HDL-C浓度百分比显著升高(P=0.002和P＜0.001),大颗粒HDL-C浓度和大颗粒HDL-C浓度占HDL-C浓度百分比显著降低(P=0.001和P＜0.001)。在中位随访时间为37.7个月中，T2DM合并SCAD组患者CVEs的发生显著增加(P=0.039)。将T2DM合并SCAD组患者按照是否发生CVEs分为两组，分析发现，与无CVEs组相比，CVEs组患者具有较高的中等颗粒HDL-C浓度、小颗粒HDL-C浓度以及中等颗粒HDL-C浓度与小颗粒HDL-C浓度之和(定义为中小颗粒HDL-C浓度之和)(分别为P＜0.001,P=0.028和P＜0.001)。并且，中等颗粒HDL-C浓度以及中小颗粒HDL-C浓度之和与T2DM合并SCAD患者CVEs发生显著相关[比值比(oddsratio,OR)(95％CI):1.154(1.056-1.262),P=0.002;OR(95％CI):1.095(1.029-1.166),P=0.004]。随后，在校正了年龄、性别、高血压、CAD家族史、吸烟史、体重指数、饮酒史等变量后，中等颗粒HDL-C浓度以及中小颗粒HDL-C浓度之和与T2DM合并SCAD患者CVEs风险增加仍独立相关[校正后HR(95％CI):1.097(1.042-1.155),P＜0.001;HR(95％CI):1.061(1.024-1.100),P＜0.001]。继之，将中小颗粒HDL-C浓度之和进行二分位取值，分为低分位组(≤28mg/dL)和高分位组(＞28mg/dL),Kaplan-Meier生存分析表明，与低分位组相比，高分位组T2DM合并SCAD患者生存率降低(P=0.008)。 结论:研究结果表明中小颗粒HDL-C浓度之和与T2DM合并SCAD患者发生CVEs有关，其水平升高对患者的心血管风险增加具有预测价值。
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