摘要
第一部分M2型巨噬细胞来源的外泌体通过调节平滑肌细胞表型转换抑制动脉粥样硬化疾病进程 研究背景与目的 血管平滑肌细胞(Vascularsmoothmusclecells,VSMCs)在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发展过程中发挥重要作用。在AS发展期，大量VSMCs从中膜迁移至内膜，增殖能力增强，从收缩表型向分泌表型转换，促使斑块不断变大，管腔狭窄，狭窄处血流速度变快，斑块容易脱落形成血栓，危及生命。巨噬细胞在动脉粥样硬化中也十分重要，其中M2型巨噬细胞作为一种抗炎型细胞，在稳定的斑块中大量存在。外泌体是一种能够将母体细胞分子传递到受体细胞中并发挥作用的细胞间通讯载体，对细胞间信息交流起到重要作用。因此，本研究基于体内、体外实验探究M2型巨噬细胞来源的外泌体(M2macrophagederivedexosome,M2-exo)对平滑肌细胞表型转换和动脉粥样硬化病变的作用。 研究方法 1.用白介素-4(Interleukin-4,IL-4)诱导RAW264.7巨噬细胞细胞向M2型极化。使用超速离心法获得M2-exo,并通过纳米微粒追踪、透射电镜和免疫印迹实验(WesternBlot,WB)对外泌体粒径、纯度、表面特异性标志物进行分析。 2.用血小板衍生生长因子BB(PlateletDerivedGrowthFactor,PDGF-BB)建立平滑肌表型转换细胞模型。通过CCK8增殖实验、细胞划痕、WB评价M2-exo对平滑肌细胞表型转换的作用。 3.高脂喂养ApoE-/-小鼠16周，建立AS动物模型。从第12周开始尾静脉注射M2-exo。通过小鼠血脂水平、主动脉根部和主动脉弓油红O、H&E染色以及Masson染色来阐明M2-exo对AS疾病的作用。通过免疫组化染色来观察小鼠主动脉平滑肌细胞收缩和分泌表型标志蛋白表达水平，来阐明M2-exo对平滑肌细胞表型转换的影响。 研究结果 1.观察M2型巨噬细胞标志蛋白CD206表达情况，在荧光显微镜下CD206强阳性表达。 2.M2型巨噬细胞来源的外泌体，纳米微粒追踪结果显示有95.7％直径为139nm,透射电镜图显示其有双层膜脂质结果，WB结果显示其表达外泌体标志蛋白白细胞分化抗原63(Clusterofdifferentiation63,CD63)和肿瘤易感基因101蛋白(Tumorsusceptibilitygene101,TSG101)。 3.PDGF-BB诱导后的MOVAs平滑肌CCK8实验显示其增殖活力明显增强、细胞划痕实验表明其相对迁移率明显增大，WB显影图表明诱导后平滑肌收缩表型标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(Alphasmoothmuscleactin,α-SMA)表达减少，分泌表型标志蛋白骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)表达增加，符合收缩表型向分泌表型转换模型特征。加入M2-exo后重复上述实验，发现细胞增殖活力减弱、相对迁移率下降、α-SMA表达增加、OPN表达减少。 4.与Ctrl组小鼠相比，M2-exo组ApoE-/-小鼠血脂水平和主动脉根部胶原蛋白含量没有差异，主动脉根部和主动脉弓油红O面积明显减少，主动脉根部H&E染色中空泡面积减少，α-SMA免疫组化显色量变多，OPN显色量变少。 结论 1.RAW264.7能够被IL-4成功极化;M2型巨噬细胞培养基上清超速离心所得物质为M2-exo。 2.PDGF-BB能成功诱导平滑肌细胞表型转换模型，M2-exo能够在体外抑制PDGF-BB诱导的MOVAs平滑肌表型转换。 3.M2-exo对小鼠血脂水平和主动脉根部斑块稳定性影响不明显，但能够减少主动脉斑块面积和坏死核的面积，还能促进VSMCsα-SMA表达增加，OPN表达减少，抑制表型转换。 第二部分动脉粥样硬化免疫浸润相关生物标志物筛选 研究背景与目的 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是引发心血管疾病的主要原因，是一种慢性血管炎症，也是造成全球范围内人类死亡的主要原因。本研究旨在确定AS可能的诊断标志物，并确定其与AS中免疫细胞浸润的相关性。 研究方法 共收集10例AS患者和10例健康受试者的血清样本。从GeneExpressionOmnibus数据库下载GSE43292和GSE57691的原始基因表达谱，并对其进行最小绝对收缩和选择算子(LeastAbsoluteShrinkageandSelectionOperator,Lasso)和支持向量机递归特征消除(Supportvectormachines-RecursiveFeatureElimination,SVM-RFE)分析以确定候选标记。通过受试者工作特征曲线(Receiveroperatingcharacteristic,ROC)分析来确定生物标志物的诊断价值，使用CIBERSORT包计算AS中22种免疫细胞部分的组成模式。实时荧光定量聚合酶反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)进一步确定关键基因的表达。 研究结果 本研究在动脉粥样硬化患者血清样本中鉴定出17个差异表达基因(Differentiallyexpressedgenes,DEGs),主要涉及非小细胞肺癌、肺纤维化、多囊卵巢综合征、糖耐量异常和T细胞白血病。其中，FHL5、IBSP和SCRG1已被鉴定为动脉粥样硬化的诊断基因。动脉粥样硬化患者血清样本中SCRG1和FHL5的表达明显下调，IBSP的表达明显上调，以上结果均通过RT-PCR进一步证实。此外，免疫分析表明，FHL5、IBSP和SCRG1与多种免疫细胞相关，如细胞毒性T(CD8+T)细胞、幼稚B细胞、M0型巨噬细胞、活化的记忆CD4+T细胞和活化的自然杀伤细胞(Naturalkillercells,NK细胞)。 结论 总体而言，使用FHL5、IBSP和SCRG1基因作为AS的诊断标记物，可能会对未来AS的发生和分子机制的研究有所帮助。
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