摘要
富含多巴胺（Dopamine，DA）能神经元的中脑腹侧背盖区（VentralTegmentalArea，VTA）与其投射区域伏隔核（NucleusAccumbens，NAc）、前额叶皮质（medialprefrontalcortex，mPFC）及基底外侧杏仁核（Basolateralamygdaloidnucleus，BLA）所组成的中脑边缘皮质多巴胺奖赏环路在动机、记忆及奖赏等重要脑功能中起到至关重要的作用。这些环路中的DA能神经元的兴奋性是决定上述功能的关键因素，而神经元兴奋性的异常则与情绪相关疾病（如抑郁）、药物及酒精成瘾等疾病的发生、发展关系密切。因此，关于VTADA能神经元兴奋性分子机制的研究是了解VTADA能神经元功能的关键，也是探究多种精神疾病发病机理的重要切入点。DA能神经元大多具有自主放电，同时接受外源性输入的调控，由此产生的兴奋性状态决定DA神经递质的释放，最终编码相应的行为。DA能神经元放电模式主要有两种：低频规律2-4Hz的tonic和高频簇状15-30Hz的burst放电。相对于tonic放电，burst放电能更有效的释放DA。VTADA能神经元兴奋性的异常主要体现为放电频率的改变及放电模式的转换。 神经元兴奋性的基本表现形式是动作电位介导的神经元放电。VTADA能神经元具有自发放电活性，可以自主产生动作电位。已有研究表明多种离子通道（如电压门控Na+通道、高阈值激活的Ca2+通道、Kv2、大电导Ca2+激活K+通道、A-型及M-型K+通道）等参与并调控DA能神经元的自主放电活动。神经元动作电位的触发是电压依赖性Na+通道在膜电位去极化到其激活阈值进而促其开放，导致细胞外Na+大量内流而发生的。因此，神经元静息膜电位去极化至激活电压依赖性Na+通道的电位阈值是触发动作电位的关键之一，此过程即阈下去极化过程。目前对于VTADA能神经元中，介导阈下去极化过程的内向去极化阳离子电流的分子基础缺乏清楚的认识。因此，本课题致力于探究VTADA能神经元自发放电起始阶段触发膜电位去极化的内向离子电流的离子通道身份。 在一些能自主发放动作电位的自律性细胞，如心肌细胞和某些神经元（包括一部分中脑SNcDA能神经元），自律性的阈下触发机制是HCN通道。HCN通道是可以通透Na+的非选择性阳离子通道，在细胞膜超极化时开放，细胞外Na+、Ca2+内流使膜电位至阈电位而触发动作电位。HCN通道在VTADA能神经元自发放电中的作用也受到了关注但尚无定论。 此外，在黑质DA能等神经元中，非选择性内向阳离子通道NALCN被认为是背景Na+电流的主要贡献者之一，对神经元兴奋性具有重要的调控作用。也有研究提示NALCN在VTADA能神经元有表达，但其在去极化内向电流及调控自发放电中的作用尚不清楚。 TRP通道是一大类非选择性阳离子通道，在外周和中枢神经系统分布广泛。研究发现与TRPC6同源性较高的TRPC3可以产生去极化电流，触发动作电位，参与细胞节律性放电及心脏和神经元兴奋性的调控。TRPC及其它TRP通道成员是否参与VTADA能神经元兴奋性的调控则不得而知。我们实验结果提示TRPC6和TRPV2在VTADA能神经元高表达。 Panx1（Pannexin1）蛋白可形成连接蛋白半通道，也是一种非选择性阳离子通道。有研究显示，Panx1可以调控视网膜神经节细胞（Retinalganglioncell,RGC）兴奋性，但机制尚不清楚，其在VTADA能神经元兴奋性调控中的作用也不清楚。我们实验结果提示Panx1在VTADA能神经元高表达。 本论文研究了上述HCN、NALCN、TRPC6和Panx1在VTADA能神经元兴奋性调控中的作用，重点探讨了这些通道对VTADA能神经元内向去极化电流及神经元自发放电的贡献，在此基础上研究了它们在抑郁状态下VTADA能神经元兴奋性异常改变中的作用。 第一部分VTA区多巴胺能神经元阈下去极化及自发放电的离子机制及HCN通道的贡献 目的：观察细胞外Ca2+/Na+以及HCN通道在VTADA能神经元兴奋性调控中的作用。 方法： 1.利用离体脑片膜片钳贴附和全细胞记录技术，观察外Ca2+和Na+以及调控HCN通道功能对VTADA能神经元兴奋性的影响； 2.利用patch-Seq技术对VTADA能神经元进行全细胞转录组测序。 结果： 1.利用贴附式记录模式记录VTADA能神经元自发放电，发现去除灌流液即神经元外液（人工脑脊液，ACSF）中的Ca2+（应用Mg2+代替）后，小鼠VTADA能神经元放电频率不但没有下降，反而显著上升（Plt;0.001）。 2.利用全细胞记录模式，在TTX存在的情况下，用NMDG替代灌流液中的Na+后，静息膜电位显著超极化（Plt;0.05）。 3.对45个投射特异性小鼠VTADA能神经元进行单细胞全转录组基因测序，观察其中非选择性内向阳离子通道的表达情况，发现Panx1、TRP通道（TRPC6、TRPV2）、HCN2-3、NALCN在VTADA能神经元表达丰富。 4.HCN通道在成年小鼠VTADA能神经元放电中的作用。HCN通道阻断剂CsCl（3mM）以及ZD7288（60μm）对VTADA能神经元放电无影响（Pgt;0.05）。在投射到NAclateralshell的VTADA能神经元中可以记录到显著的HCN/Ih电流，但CsCl以及ZD7288仍然对这些神经元放电无影响。 5.HCN通道阻断剂可以抑制幼鼠VTADA能神经元的放电。ZD7288显著降低幼鼠VTADA能神经元的放电频率（Plt;0.01），而在降低记录外液K+，导致细胞超极化的情况下，ZD7288也可以显著降低成年鼠VTADA神经元的放电频率（Plt;0.01）。 结论： 1.小鼠VTADA能神经元阈下去极化内向电流的离子组成主要为Na+，Ca2+对其贡献较小。 2.有多种非选择性内向阳离子通道在小鼠VTADA能神经元高表达，这些通道有可能参与阈下去极化过程，后续研究将围绕这些通道进行。 3.HCN通道并未参与成年鼠VTADA能神经元自发放电过程，但是却对幼鼠VTADA能神经元兴奋性有重要调控作用，其机制可能为HCN通道激活曲线随年龄逐步向左（超极化）移动。 第二部分NALCN通道在VTA区多巴胺能神经元自发放电中的作用 目的：研究NALCN通道是否参与VTA区DA能神经元阈下背景Na+电流以及对小鼠VTADA能神经元放电频率的影响，并观察在抑郁模型中小鼠VTA区NALCN通道蛋白有无改变。 方法： 1．利用免疫荧光和单细胞PCR技术，观察NALCN在VTADA能神经元蛋白及mRNA水平的表达； 2.利用离体脑片膜片钳贴附和全细胞记录技术，观察阻断或敲低NALCN通道对VTADA能神经元放电频率以及静息膜电位的影响； 3.利用Westernblot技术，观察小鼠VTA区NALCN蛋白含量。 结果： 1.免疫荧光结果显示，NALCN通道高表达在小鼠VTADA能神经元中；单细胞PCR结果也证明，在大多数小鼠VTADA能神经元内均有NALCNmRNA的表达。 2.利用膜片钳贴附式以及全细胞记录模式，观察到给予NALCN阻断剂GdCl3后，小鼠VTADA能神经元静息膜电位从给药前的-53.60±4.78mV超极化至-67.80±3.23mV（Plt;0.05），同时VTA区DA能神经元自发放电频率也明显降低（Plt;0.01）。 3.用shRNA技术敲除小鼠VTA区NALCN后，VTADA能神经元放电频率为0.07±0.04Hz，显著低于表达无意义shRNA的VTADA能神经元（Plt;0.05）；同时与感染无意义shRNA的DA能神经元静息膜电位（-48.9±1.45mV）相比，敲低NALCN通道后，DA能神经元静息膜电位显著超级化至-60.67±2.33mV（Plt;0.05）。 4.蛋白印迹检测结果显示，在CSDS和CMUS两种抑郁模型中，抑郁小鼠与对照小鼠相比，VTA组织中NALCN蛋白的表达量没有差异。 结论： 1.NALCN在大多数VTADA能神经元中有表达。 2.NALCN通道对VTADA能神经元静息膜电位稳态的维持以及自发放电的调控具有至关重要的作用。 3.在CSDS和CMUS两种模型中，VTA区NALCN通道在蛋白表达层面没有改变。 第三部分TRP通道在VTA区多巴胺能神经元自发放电中的作用 目的：探究TRP通道（以TRPC6为重点）在VTADA能神经元自发放电中的作用及机制，并探讨不同抑郁模型中TRPC6通道的改变以及调控TRPC6对动物抑郁样行为的影响。 方法： 1.应用贴附式及全细胞膜片钳技术，观察TRP通道阻断剂对VTADA能神经元放电频率以及静息膜电位的影响； 2.观察应用TRPC6以及TRPV阻断剂对VTADA能神经元自发放电的影响； 3.利用免疫荧光以及单细胞PCR技术，了解TRPC6在VTADA能神经元的表达情况； 4.利用基因敲低技术，观察敲低TRPC6对VTADA能神经元放电频率以及静息膜电位的影响； 5.利用Westernblot、行为学检测手段以及电生理技术，观察在多种抑郁模型中，VTA区TRPC6蛋白表达的改变，以及TRP阻断剂对抑郁敏感小鼠VTADA能神经元自发放电抑制能力的改变； 6.利用Cre-Loxp特异性基因敲低技术，观察特异性敲低VTADA能神经元TRPC6对小鼠行为的影响。 结果： 1.应用全细胞膜片钳电流钳方式，发现在TTX存在的基础上，给予Flufenamicacid（FFA）后，小鼠VTA区DA能神经元静息膜电位由-50.50±2.36mV超极化至-69.65±2.06mV（Plt;0.01）。类似，2-AminoethylDiphenylborinate（2-APB）也使VTADA能神经元静息膜电位显著超级化（从-51.01±2.20mV超极化至-61.64±1.28mV，Plt;0.01）。用贴附式膜片钳方式，发现利用FFA和2-APB阻断TRP通道均可明显降低这些神经元自发放电频率（Plt;0.001）。 2.单细胞PCR实验与免疫荧光结果同时显示TRPC6与TRPV2在小鼠VTADA能神经元有较高表达。 3.利用膜片钳贴附式记录模式，观察到TRPC6特异性阻断剂larixylacetate（LA）可显著降低小鼠VTA区DA能神经元自发放电频率（Plt;0.01）。同时观察了TRPV通道阻断剂钌红（RutheniumRed，RR）对DA能神经元放电的影响，结果较为复杂，整体上看，所记录的全部DA细胞给予RR前后放电频率经检验无显著性改变（Pgt;0.05）。 4.利用AAV腺相关病毒敲低技术，观察到敲低TRPC6使小鼠VTADA能神经元静息膜电位呈现明显的超极化状态（-55.04±2.00mV），显著低于被含无意义序列的AAV病毒感染的VTADA能神经元（-49±1.18mV，Plt;0.05），放电频率也显著低于被含无意义序列的AAV病毒感染的VTADA能神经元（Plt;0.05）。此外，对于TRPC6敲低的DA能神经元，2-APB对其兴奋性的抑制作用也大大减弱（Pgt;0.05）。 5.Westernblot结果显示，CMUS模型小鼠与CRS小鼠VTA区TRPC6蛋白较对照小鼠明显下降（Plt;0.05）。相反，在CSDS模型小鼠，VTA区TRPC6蛋白较对照小鼠则无显著性改变（Pgt;0.05）。 6.利用脑片钳贴附式记录模式，观察到2-APB对CMUS小鼠神经元放电的抑制作用与对照小鼠相比，显著性下降（Plt;0.05）。 7.利用Loxp-Cre技术以及病毒敲低技术，选择性敲低VTADA能神经元TRPC6后，观察到悬尾实验小鼠不动时间明显高于对照小鼠（Plt;0.001）；在十字高架实验中，小鼠停留于开放臂的时间明显低于对照鼠（Plt;0.01）；而在糖水偏爱实验中，与对照鼠相比，特异性敲低VTADATRPC6后小鼠表现出糖水偏爱率下降（Plt;0.05）。 结论： 1.TRP通道通过参与VTADA能神经元阈下去极化而影响自发放电。 2.在VTADA能神经元中，TRPC6和TRPV2有较高表达。 3.阻断TRPC6可显著降低VTADA能神经元自发放电频率；而从整体上看，阻断TRPV则对VTADA能神经元自发放电频率无显著影响。 4.敲低VTA区DA能神经元中的TRPC6后，膜电位超极化，抑制自发放电。 5.在CMUS以及与其造模手段相似的CRS抑郁模型中，VTA区TRPC6蛋白水平明显下降。CMUS小鼠VTA区DA能神经元放电频率的下降与TRPC6表达下调有关。 6.选择性敲低VTADA能神经元TRPC6通道后，小鼠表现出明显的抑郁样行为。 7.TRPC6的表达/功能下调可能是CMUS抑郁模型小鼠VTADA能神经元放电减少及出现抑郁样行为的重要机制。 第四部分Pannexins1（Panx1）通道在VTADA能神经元自发性放电中的作用 目的：探究Panx1通道在VTADA能神经元自发放电中的作用，并探讨不同抑郁模型中Panx1通道的改变以及调控Panx1对动物抑郁样行为的影响。 方法： 1.应用贴附式膜片钳技术，观察Panx通道阻断剂对VTADA能神经元放电频率的影响； 2.利用免疫荧光以及单细胞PCR技术，了解Panx1在VTADA能神经元的表达情况； 3.利用基因敲低技术，观察敲低Panx1对VTADA能神经元放电频率的影响； 4.利用Westernblot、行为学检测手段以及电生理技术，观察在多种抑郁模型中，VTA区Panx1蛋白表达的改变，以及Panx阻断剂对抑郁敏感小鼠VTADA能神经元自发放电抑制能力的改变； 5.利用基因过表达技术，观察特异性提高VTADA能神经元Panx1蛋白水平后对小鼠行为的影响。 结果： 1.免疫荧光及单细胞PCR结果显示，小鼠VTADA能神经元中Panx1均有较高表达。 2.脑片钳贴附式记录模式，观察到Panx阻断剂甘珀酸（Carbenoxolone，CBX）可显著降低小鼠VTADA能神经元自发放电频率（Plt;0.001）。利用shRNA，将VTADA能神经元的Panx1沉默之后发现DA能神经元放电显著降低（Plt;0.05）。 3.利用Westernblot技术，观察在CSDS模型中，有抑郁行为的小鼠VTA区Panx1蛋白较对照小鼠明显增高（Plt;0.001），而在CMUS模型中则无明显变化（Pgt;0.05）。 4.通过膜片钳贴附式记录模式，观察到与正常小鼠相比，CBX对抑郁型小鼠神经元放电的抑制作用显著性上升（Plt;0.05）。 5.通过离体脑片贴附式记录方法，利用loxp-cre技术，特异性过表达Panx1通道于小鼠VTADA能神经元后，发现过表达Panx1基因的VTADA能神经元自发放电频率显著高于对照细胞（Plt;0.05）。此外，对于过表达Panx1的DA能神经元，CBX对其放电的抑制率也明显增强（Plt;0.001）。 6.在阈下社交应激挫败刺激下，上述选择性过表达Panx1通道的小鼠出现抑郁样行为的小鼠数目明显多于注射携带无意义序列病毒的小鼠。 结论： 1.在蛋白及mRNA水平，Panx1在VTADA能神经元中均有较高表达。 2.阻断或者沉默Panx1均可使VTADA能神经元兴奋性下降。 3.CSDS模型VTADA能神经元放电增加，Panx1阻断剂CBX对其作用也增加；VTADA能神经元过表达Panx1后神经元放电频率增加，CBX对其作用也增加。 4.在VTADA能神经元选择性过表达Panx1通道后，小鼠抑郁易感性上升。 5.Panx1的表达/功能上调可能是CSDS抑郁模型小鼠VTADA能神经元放电增加及出现抑郁样行为的重要机制。
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