摘要
研究背景及目的 我国超过1.7亿人生活在高于海平面2500米以上的地区。在这些地区，氧气含量较少，导致机体慢性缺氧，反应时间延迟，损害运动功能，极端海拔暴露（＞5000米）环境中氧含量更低，可能导致更明显的损害。大脑需要一个精确平衡的氧气供应，并通过改变大脑循环对氧气和二氧化碳水平变化的反应来适应缺氧状态。 生命早期是神经发育的重要时期，神经干细胞不断增殖分化为神经元，尽管神经回路是在人类胚胎发育的后期甚至在出生后形成的，但不同类型的功能细胞会在发育早期生成并迁移到适当的位置。然而，发育早期高海拔暴露的研究相对缺乏，尤其是高海拔缺氧对后代高级认知功能的潜在影响。 由于神经元生成、迁移、突触连接的形成都需要物质和能量合成大量蛋白和氨基酸，需要充足营养和氧供，因此线粒体的正常运作对神经元发育至关重要。研究显示线粒体功能障碍是导致脑损伤和认知功能损害的许多疾病的标志，如遗传性线粒体疾病、神经变性疾病和衰老等。事实上，在线粒体疾病中，无论是儿童期还是成年期，最常受影响的器官都是中枢神经系统，其临床表现包括运动障碍、认知衰退甚至痴呆。尽管线粒体在大脑中具有明显的重要性，但这些细胞器在发育和神经发生过程中发挥的确切作用尚不清楚。 CIRBP最初是被筛选为DNA损伤诱导的基因转录本，在控制细胞对缺氧、紫外线辐射、葡萄糖剥夺、热应激和H2O2等各种异常环境应激的反应中发挥关键作用。前期研究结果显示长期低氧暴露CIRBP表达降低；同时CIRBP参与成年小鼠的学习记忆损伤机制；进一步发现CIRBP参与调控成年小鼠线粒体损伤。 本实验以C57BL/6孕鼠、原代神经元为研究对象，观察孕期慢性低氧暴露对子代小鼠神经元成熟过程尤其是子代小鼠高级脑功能的影响。明确神经元成熟异常及功能障碍在其中发挥的作用，探讨线粒体功能改变在神经元成熟过程中的重要作用，进一步阐明CIRBP分子在其过程中发挥的关键分子机制，为孕期慢性低氧暴露诱导的高级脑功能损伤的防治提供有效靶点。 研究方法 1.建立孕期低氧暴露动物模型： 以C57BL/6孕鼠为研究对象，分为对照组与低氧暴露组，处理组暴露于复合环境模拟实验舱中，海拔设置为4000米（温度22～24℃，相对湿度40%～70%），E14.5天开始暴露直至子代小鼠出生后10周。检测P0d、P3d、P5d、P7d、P14d、P21d及P70d小鼠身长、体重及脑重；通过条件恐惧箱、新物体识别及水迷宫实验检测子代小鼠高级脑功能；电生理检测神经元mEPSCs；Westernblot检测神经元突触相关分子表达；试剂盒检测谷氨酸浓度。 2.孕期低氧暴露对P7d及P14d小鼠海马神经元成熟的影响 Westernblot、RT-qPCR及免疫荧光染色检测子代小鼠大脑未成熟神经元双肾上腺皮质激素（Doublecortin，DCX）、成熟神经元微管相关蛋白（Microtubule-associatedprotein2，MAP2）及突触前膜相关蛋白表达。 3.建立低氧暴露细胞模型： C57BL/6孕鼠（E14.5天左右）原代培养神经元至第4天，将其暴露于低氧工作站（DWS）中，设置1%氧浓度（37℃，5%CO2），暴露时间为2、3、6及9天。CCK8实验检测神经元细胞活力；TUNEL染色及Westernblot检测神经元凋亡；Westernblot、RT-qPCR及免疫荧光染色检测神经元成熟相关指标；钙振荡检测原代神经元功能。 4.低氧引起的线粒体功能改变对神经元成熟的调控作用 通过透射电镜检测子代小鼠海马部位神经元及原代神经元线粒体超微结构；增强型ATP试剂盒检测小鼠海马部位及原代神经元ATP水平；试剂盒检测小鼠海马部位及原代神经元呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ的活性；RT-qPCR检测子代小鼠海马部位线粒体呼吸链复合体相关基因（Ndufv-1、Ndufb-8、SDHA、SDHB、Uqcrh及ATP5a）mRNA表达水平；Westernblot检测线粒体复合体蛋白及分裂融合蛋白基因。CCK8实验检测神经元细胞活力同时筛选合适的ATP作用浓度；免疫荧光染色检测补充ATP对低氧暴露6天神经元形态的影响；Westernblot检测补充ATP对低氧暴露6天DCX、MAP2、Tau及突触前膜蛋白表达水平的影响。 5．CIRBP对低氧诱导的神经元成熟异常的调控作用 Westernblot及RT-qPCR检测子代小鼠海马部位及原代神经元CIRBP分子的表达；检测CIRBPKO鼠孕期低氧暴露子代P14d小鼠体重变化；Westernblot检测CIRBPKO鼠孕期低氧暴露P14d小鼠未成熟神经元DCX、成熟神经元MAP2、微管相关蛋白Tau（Microtubule-associatedproteintau）及突触前膜蛋白Synaptotagmin1及Synaptotagmin2分子蛋白表达变化；免疫荧光染色及Westernblot检测神经元过表达CIRBP分子和过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元细胞形态、DCX、MAP2及突触前膜蛋白在低氧环境下的表达变化。 6．CIRBP对低氧诱导的神经元线粒体能量代谢障碍的调控作用 ATP试剂盒检测神经元过表达CIRBP分子和过表达CIRBP基因鼠提取的神经元细胞内ATP水平；试剂盒检测神经元过表达CIRBP分子和过表达CIRBP基因鼠提取的神经元线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ的活性在低氧暴露6天的变化；Westernblot及RT-qPCR检测呼吸链复合体蛋白及mRNA水平变化；透射电镜检测过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元在低氧环境下线粒体超微结构的变化；Westernblot检测过表达CIRBP基因鼠提取的神经元线粒体分裂蛋白在低氧环境下的表达水平。 主要研究结果 1.成功建立孕期低氧动物模型 1）C57BL/6孕鼠暴露于海拔4000米复合环境模拟实验舱中直至子代小鼠出生，检测P0d、P3d、P5d、P7d、P14d及P21d小鼠生长发育指标，结果显示，孕期低氧暴露P7d、P14d、P21d小鼠身长显著低于对照组（P＜0.0001），P5d、P7d、P14d及P21d小鼠体重低氧组与对照组相比显著降低。 2）检测P7d及P14d子代小鼠大脑发育，结果显示，低氧组小鼠脑重均低于对照组，P14d小鼠脑重/体重低氧组高于对照组，结果具有统计学差异（P＜0.001）。 3）条件恐惧箱实验显示，P14d低氧组小鼠恐惧次数显著低于对照组（P＜0.001）；新物体识别实验显示，低氧组P14d小鼠新物体识别次数与识别指数均显著低于对照组（P＜0.0001），结果说明孕期低氧暴露导致P14d小鼠学习记忆损伤；水迷宫实验检测P70d小鼠学习记忆情况，结果显示，低氧组小鼠目的象限停留时间与对照组小鼠相比显著降低（P＜0.05），说明低氧暴露也会造成出生后成年小鼠的学习记忆功能受损。 4）Westernblot及RT-qPCR检测P3d、P5d、P7d及P14d小鼠大脑未成熟神经元DCX和成熟神经元MAP2表达，结果显示，随着出生时间的延长MAP2蛋白水平逐渐升高，DCX蛋白水平逐渐降低，说明小鼠发育正常，低氧组P7d及P14d小鼠DCX蛋白水平明显高于对照组（P＜0.01），MAP2蛋白水平显著低于对照组（P＜0.001）。同时P7d低氧组小鼠DCXmRNA水平高于对照组（P＜0.001），MAP2mRNA水平低于对照组（P＜0.0001）；P14d小鼠两组间变化趋势与P7d一致。以上实验结果说明孕期低氧暴露导致小鼠大脑神经元的成熟受到抑制。 5）进一步对孕期低氧暴露子代小鼠大脑突触相关蛋白的检测发现，突触后膜NMDA受体NR1、NR2A，AMPA受体GluR1及P-831-GluR1蛋白水平两组间均无显著差异，然而P14d低氧组小鼠大脑突触前膜蛋白Syntaxin1A（Stx-1A）水平显著低于对照组（P＜0.01）。 2.孕期低氧暴露能够影响P7d及P14d小鼠海马神经元成熟 1）免疫荧光染色结果显示，P14d小鼠海马部位DG区DCX阳性细胞数低氧组显著高于对照组（P＜0.01），DCX阳性细胞数所占厚度低氧组与对照组相比显著增厚（P＜0.01），成熟神经元NeuN（RNAbindingproteinfox-1homolog3，RNA结合蛋白fox-1同源物）阳性细胞数低氧组低于对照组（P＜0.01），NeuN阳性细胞数所占厚度低氧组与对照组相比变薄（P＜0.01）。 2）Westernblot检测P7d及P14d小鼠海马部位DCX与NeuN蛋白水平，结果显示，P7d低氧组小鼠海马部位DCX蛋白水平高于对照组（P＜0.05），NeuN蛋白水平低于对照组（P＜0.05）；P14d低氧组DCX蛋白水平显著高于对照组（P＜0.01），NeuN蛋白水平明显低于对照组（P＜0.01）。 3）RT-qPCR检测P7d及P14d小鼠海马部位DCX与NeuNmRNA水平，结果显示，P7d低氧组小鼠海马部位DCXmRNA水平高于对照组（P＜0.05），NeuNmRNA表达低于对照组（P＜0.05）；P14d低氧组小鼠海马部位DCXmRNA水平显著高于对照组（P＜0.01），NeuNmRNA水平显著低于对照组（P＜0.01），与蛋白结果一致。 4）Westernblot检测小鼠海马部位突触前膜相关蛋白（Munc13-1、Synaptotagmin1、Synaptotagmin2、Munc18-1及VAMP2）水平，结果显示，P7d低氧组小鼠Munc13-1、Syn1及Munc18-1蛋白水平与对照组相比表达降低；P14d低氧组小鼠Munc13-1、Syn1、Syn2、Munc18-1及VAMP2蛋白水平均有不同程度下降。综合以上实验结果说明孕期低氧暴露导致P14d小鼠大脑海马部位神经元成熟异常，表现为未成熟神经元表达增多，成熟神经元表达降低，同时突触前膜蛋白表达下降，突触成熟受阻。 5）神经元mEPSCs检测发现，孕期低氧暴露P14d小鼠海马神经元mEPSC频率显著低于对照组（P＜0.001），振幅两组间无明显差异，提示孕期低氧暴露可能导致子代P14d小鼠海马突触前膜受损。 6）同时检测P14d小鼠海马部位细胞内谷氨酸浓度，发现低氧组P14d小鼠海马部位谷氨酸浓度与对照组相比显著增加（P＜0.001），兴奋性谷氨酸的蓄积可能与突触前膜相关蛋白表达降低有关，阻碍了谷氨酸的释放。 3.低氧暴露影响小鼠原代神经元成熟及其功能 1）CCK8实验检测低氧暴露对神经元细胞活力的影响，结果显示，低氧暴露3天及6天细胞活力两组间无明显差异；低氧暴露9天，低氧组细胞活力低于对照组（P＜0.05）。 2）TUNEL实验检测低氧暴露对细胞凋亡的影响，结果发现低氧暴露3天和6天细胞并未发生凋亡；低氧暴露9天低氧组细胞明显发生凋亡现象。 3）Westernblot检测低氧暴露对Cleaved-caspase3及Caspase3蛋白的影响，结果显示，低氧暴露3天及6天Cleaved-caspase3/Caspase3两组间无明显改变；低氧暴露9天低氧组Cleaved-caspase3/Caspase3与对照组相比显著升高（P＜0.01）。以上结果说明低氧暴露6天细胞活力无明显变化，也未发生凋亡。 4）Westernblot检测神经元低氧暴露2、3、6及9天DCX、MAP2、Tau、Syn2、Munc18-1及VAMP2蛋白表达水平，结果显示，低氧暴露3天、6天及9天低氧组DCX蛋白水平与对照组相比均升高，暴露时间越长升高越显著，而MAP2、轴突标志物Tau蛋白及突触前膜相关蛋白Munc18-1、Syn2及VAMP2表达与对照组相比均有不同程度降低，同样随着暴露时间延长降低越明显。 5）RT-qPCR检测神经元低氧暴露2、3、6及9天DCX与MAP2mRNA水平，结果显示，低氧暴露3天开始低氧组细胞DCXmRNA水平与对照组相比增加，随着暴露时间的延长增加越显著，成熟神经元MAP2mRNA水平从低氧暴露2天开始即出现下降，暴露时间越长，下降越明显，与蛋白结果一致。 6）免疫荧光染色检测神经元DCX与MAP2荧光表达，结果显示，低氧暴露3、6及9天低氧组DCX/MAP2比值与对照组相比均升高，暴露时间越长升高越明显。同时低氧暴露6天神经元形态与对照组相比有明显差异，神经元突起明显变短（P＜0.01）。 7）激光共聚焦活细胞工作站检测低氧暴露对神经元钙振荡发生的影响，结果显示，低氧暴露6天低氧组细胞钙振荡发生振幅与对照组相比显著降低（P＜0.01），钙振荡发生频率与对照组相比升高，低氧暴露6天神经元钙振荡表现为低振幅高频率，这种钙振荡可能不足以行使正常的细胞功能；而在低氧暴露9天低氧组细胞钙振荡发生无论振幅还是频率与对照组相比均降低（P＜0.05）。以上实验说明低氧暴露6天神经元未发生凋亡现象，然而其成熟受到明显抑制，神经元功能发生障碍。 4.低氧引起的线粒体功能改变进一步影响神经元成熟 1）透射电镜检测线粒体超微结构，结果显示，孕期低氧暴露子代P14d低氧组小鼠海马部位神经元线粒体数目与对照组相比显著降低（P＜0.01），线粒体平均面积显著减少（P＜0.05），提示低氧影响其线粒体形态。同时检测神经元线粒体形态发现，低氧暴露6天神经元低氧组线粒体发生肿胀，线粒体嵴减少、变短。结果说明随着低氧暴露时间的延长，神经元线粒体嵴表现为进行性损伤。 2）增强型ATP试剂盒检测小鼠海马部位ATP水平，结果显示，P7d及P14d小鼠低氧组ATP水平均明显低于对照组（P＜0.01）。神经元低氧暴露6天及9天细胞内ATP水平与对照组相比显著下降（P＜0.0001）。补充0.1mMATP，低氧暴露6天补充ATP组与低氧组相比神经元细胞内ATP水平显著回调（P＜0.001）；然而低氧暴露9天补充ATP组与低氧组相比无显著差异，实验结果说明补充0.1mMATP可以回调低氧暴露6天所造成的ATP降低，然而并不能恢复低氧9天所造成的ATP下降。 3）试剂盒检测小鼠海马部位呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ的活性，结果显示，P14d低氧组小鼠海马组织呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ的活性与对照组相比均显著降低（P＜0.01）。呼吸链复合体Ⅲ两组间无差异。同时检测神经元线粒体呼吸链复合体活性，结果显示，低氧暴露6天神经元呼吸链复合体Ⅰ低氧组与对照组相比降低（P＜0.05），复合体Ⅱ和Ⅴ的活性与对照组相比均显著降低（P＜0.01）。结果说明低氧导致的ATP水平下降与呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ的活性降低密切相关。 4）Westernblot检测小鼠海马组织呼吸链复合体相关分子蛋白表达水平，结果显示，P14d小鼠海马组织Ndufb-8（复合体Ⅰ）、MTCO1（复合体Ⅳ）及ATP5a（复合体Ⅴ）蛋白水平低氧组显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01）。低氧暴露对神经元线粒体呼吸链复合体蛋白的影响与动物结果基本一致。 5）RT-qPCR检测小鼠海马组织呼吸链复合体相关分子mRNA表达水平，结果显示，P14d低氧组小鼠海马组织Ndufv1（复合体Ⅰ）、Ndufb-8（复合体Ⅰ）及SDHA（复合体Ⅱ）与对照组相比表达降低，结果具有统计学差异（P＜0.01）。而SDHB（复合体Ⅱ）及Uqcrh（复合体Ⅲ）两组间mRNA表达水平无显著差异。ATP5a（复合体Ⅴ）mRNA表达水平低氧组显著低于对照组，结果具有统计学差异（P＜0.001）。以上结果说明低氧暴露导致P14d小鼠海马部位呼吸链复合体Ⅰ（Ndufv-1及Ndufb-8）、复合体Ⅱ（SDHA）及复合体Ⅴ（ATP5a）mRNA水平降低。低氧暴露对神经元线粒体呼吸链复合体mRNA水平的影响与动物结果基本一致。 6）Westernblot检测小鼠海马部位线粒体分裂融合蛋白表达，结果显示，P14d低氧组小鼠海马组织分裂蛋白Drp1与对照组相比表达降低（P＜0.05），分裂蛋白Fis1表达与对照组相比显著下降（P＜0.01）。同时检测神经元线粒体分裂基因Drp1及Fis1蛋白水平的表达，结果显示，低氧暴露6天Drp1及Fis1表达与对照组相比均降低（P＜0.05）。以上结果说明线粒体能量代谢的紊乱进一步导致线粒体动力学发生改变。 7）免疫荧光染色检测补充ATP对低氧暴露6天神经元形态的影响，结果显示，低氧暴露6天低氧组神经元与对照组相比突起明显变短（P＜0.001），补充0.1mMATP，低氧补充ATP组与低氧组相比突起长度有所恢复（P＜0.01）。Westernblot检测补充ATP对低氧暴露6天DCX、MAP2及Tau蛋白表达水平的影响，结果显示，低氧暴露6天低氧组DCX蛋白水平与对照组相比升高（P＜0.01），补充0.1mMATP，低氧补充ATP组与低氧组相比DCX表达有所回调（P＜0.05），MAP2及Tau蛋白表达低氧组与对照组相比均降低，补充0.1mMATP，低氧ATP组与低氧组相比蛋白表达均有不同程度恢复。同时检测补充ATP对低氧暴露6天神经元突触前膜相关蛋白表达水平，结果显示，低氧暴露6天低氧组Munc13-1、Syn1、Syn2、Munc18-1及VAMP2蛋白表达低氧组与对照组相比均降低，补充0.1mMATP，低氧加ATP组与低氧组相比Syn1、Syn2、Munc18-1及VAMP2蛋白均有不同程度恢复。以上结果明确低氧暴露造成的神经元成熟异常是线粒体ATP水平降低引起的。 5．CIRBP参与低氧诱导的神经元成熟异常 1）Westernblot检测孕期低氧暴露对子代小鼠海马部位CIRBP蛋白表达的影响，结果显示，P0d及P3d天小鼠低氧组CIRBP蛋白表达升高（P＜0.05）；P5d及P7d小鼠两组间CIRBP蛋白表达无明显差异；P14d及P21d小鼠低氧组CIRBP蛋白水平与对照组相比均显著降低（P＜0.01）。免疫荧光染色检测P14d小鼠海马部位CIRBP、DCX与NeuN的表达变化，结果显示，P14d低氧组小鼠海马DG区CIRBP表达与对照组相比降低，DCX表达增多，NeuN的表达与对照组相比显著降低，提示CIRBP分子的降低可能参与神经元的成熟。Westernblot检测原代神经元低氧暴露2、3、6及9天CIRBP蛋白的表达变化，结果显示，低氧暴露2天CIRBP蛋白表达显著升高（P＜0.01）；低氧暴露3天CIRBP蛋白水平降低（P＜0.05）；暴露6天表达进一步降低（P＜0.01）。RT-qPCR检测神经元低氧暴露2、3、6及9天CIRBP分子mRNA表达变化，结果显示，低氧暴露2天CIRBPmRNA水平升高（P＜0.01），低氧暴露3天CIRBPmRNA水平降低（P＜0.01），暴露6天表达进一步降低（P＜0.001），与蛋白结果一致。 2）检测CIRBPKO鼠孕期低氧暴露子代P14d小鼠体重变化，结果显示，对照组CIRBPKOP14d小鼠与WT对照组小鼠相比，体重降低（P＜0.001）。孕期低氧暴露CIRBPKOP14d小鼠与WT低氧组小鼠相比，体重进一步降低（P＜0.01）。结果提示，敲除CIRBP基因本身即会影响小鼠的体重增长，当给予外界环境低氧刺激时，体重降低更显著。 3）通过Westernblot检测CIRBPKO鼠孕期低氧暴露P14d小鼠未成熟神经元DCX、成熟神经元MAP2、Tau及突触前膜蛋白Syn1和Syn2分子蛋白表达变化。结果显示，对照组CIRBPKOP14d小鼠与WT对照组小鼠相比，DCX蛋白表达增多，MAP2、Tau及突触前膜蛋白Syn1和Syn2表达下降，说明敲除CIRBP基因对小鼠大脑海马部位神经元成熟造成一定影响。孕期低氧暴露CIRBPKOP14d小鼠与WT低氧组小鼠相比DCX蛋白表达进一步增多，MAP2、Tau、Syn1和Syn2表达进一步下降，说明CIRBPKO鼠孕期低氧暴露子代小鼠在低氧暴露环境下其成熟抑制更显著。侧面说明CIRBP参与低氧暴露抑制神经元成熟的过程。 4）免疫荧光染色检测神经元过表达CIRBP分子DCX与MAP2在低氧环境下的表达，结果显示，低氧暴露6天NC+Hyp与NC+Con组相比DCX/MAP2细胞数与对照组相比显著升高（P＜0.001），而CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比DCX/MAP2下降（P＜0.001），同时神经元突起长度也有所恢复。同时检测突触前膜分子Syn1在低氧环境下的荧光表达变化，结果显示，低氧暴露6天NC+Hyp与NC+Con组相比Syn1荧光强度明显降低，而CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比其荧光强度增加，说明CIRBP可能回调低氧造成的神经元突触前膜损伤。 5）Westernblot检测过表达CIRBP分子神经元DCX、MAP2及Tau蛋白在低氧环境下的表达，结果显示，低氧暴露6天NC+Hyp与NC+Con组相比未成熟神经元DCX表达升高，CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比表达下降（P＜0.05），MAP2及Tau蛋白低氧暴露后表达降低，而CIRBP+Hyp与NC+Hyp相比蛋白水平均有所上调（P＜0.05）。同时检测神经元突触前膜相关蛋白表达，结果显示，低氧暴露6天与对照组相比Munc13-1、Syn1、Syn2、Munc18-1及VAMP2蛋白表达降低，过表达CIRBP分子，CIRBP+Hyp与NC+Hyp相比Syn1、Syn2及Munc18-1蛋白水平有不同程度恢复，Munc13-1与VAMP2两组间无统计学差异，说明CIRBP分子会部分恢复低氧造成的突触前膜蛋白表达降低。 6）免疫荧光染色检测过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元在低氧环境下的细胞形态，结果显示，低氧暴露6天WTHyp与WTCon组相比神经元突起长度变短（P＜0.0001），而Cre-CIRBPHyp与WTHyp组相比其突起长度明显有所恢复（P＜0.001）。 7）Westernblot检测过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元DCX、MAP2及Tau蛋白在低氧暴露环境下的表达情况，结果显示，低氧暴露6天WTHyp与WTCon组相比DCX表达升高（P＜0.01），MAP2及Tau蛋白低氧暴露后表达降低，Cre-CIRBPHyp与WTHyp组相比DCX蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），MAP2及Tau蛋白均有不同程度升高。同时检测神经元突触前膜相关蛋白在低氧暴露6天的表达变化，结果显示，WTHyp与WTCon组相比Munc13-1、Munc18-1、Syn1、Syn2及VAMP2蛋白水平在低氧暴露后表达均降低，Cre-CIRBPHyp与WTHyp组相比Munc18-1、Syn1、Syn2分子表达均有不同程度回调，结果与神经元过表达CIRBP分子一致，以上结果确证CIRBP可以恢复低氧造成的神经元成熟异常。 8）试剂盒检测过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元在低氧环境下细胞内谷氨酸浓度变化，结果显示，低氧暴露6天WTHyp与WTCon组相比细胞内谷氨酸浓度显著升高，结果具有统计学差异（P＜0.01），Cre-CIRBPHyp与WTHyp组相比谷氨酸浓度显著回调（P＜0.01），说明CIRBP能够恢复低氧造成的兴奋性神经递质释放障碍。 6．CIRBP参与低氧诱导的神经元线粒体能量代谢障碍 1）ATP试剂盒检测神经元过表达CIRBP分子细胞内ATP水平在低氧环境下的表达变化，结果显示，低氧暴露6天NC+Hyp与NC+Con组相比ATP水平显著降低（P＜0.0001），CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比细胞内ATP水平显著回调（P＜0.01）。说明CIRBP能够回调低氧暴露6天造成的神经元ATP水平降低。过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元ATP水平在低氧暴露6天的表达变化趋势与神经元过表达CIRBP分子结果一致。 2）试剂盒检测神经元过表达CIRBP分子线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ的活性在低氧暴露6天的变化，结果显示，低氧暴露6天NC+Hyp与NC+Con组相比呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ活性降低，过表达转染CIRBP病毒，CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比复合体Ⅰ和Ⅴ的活性明显升高。过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元线粒体呼吸链复合体活性在低氧暴露6天的变化趋势与转染CIRBP病毒结果一致。 3）Westernblot检测过表达CIRBP分子线粒体呼吸链复合体蛋白在低氧暴露6天的变化，结果显示，NC+Hyp与NC+Con组相比Ndufb-8（复合体Ⅰ）和ATP5a（复合体Ⅴ）蛋白水平显著降低，结果具有统计学意义（P＜0.01），CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比蛋白水平均有部分回调（P＜0.05）。 4）RT-qPCR检测过表达CIRBP分子线粒体呼吸链复合体mRNA在低氧暴露6天的表达变化，结果显示，NC+Hyp与NC+Con组相比Ndufb-8（复合体Ⅰ）和ATP5a（复合体Ⅴ）mRNA水平显著降低（P＜0.01，P＜0.001），CIRBP+Hyp与NC+Hyp组相比mRNA水平均有明显回调（P＜0.001，P＜0.01）。 5）透射电镜检测过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元在低氧环境下线粒体超微结构的变化，结果显示，低氧暴露6天WTHyp与WTCon组相比线粒体发生肿胀，线粒体嵴异常，表现为嵴数目减少、变短，Cre-CIRBPHyp与WTHyp组相比线粒体嵴形态有一定程度的恢复。 6）Westernblot检测过表达CIRBP基因孕鼠提取的神经元线粒体分裂蛋白在低氧环境下的表达水平，结果显示，低氧暴露6天WTHyp与WTCon组相比分裂蛋白Drp1与Fis1水平降低，Cre-CIRBPHyp与WTHyp组相比Drp1与Fis1蛋白水平均有不同程度升高。 研究结论 1.孕期低氧暴露导致小鼠大脑发育迟缓，子代P14d小鼠海马部位神经元成熟异常，小鼠空间学习记忆损伤； 2.低氧暴露导致神经元线粒体形态异常，功能障碍； 3.CIRBP通过调控Ndufb-8（复合体Ⅰ）及ATP5a（复合体Ⅴ）恢复呼吸链复合体Ⅰ及Ⅴ的活性，回调低氧造成的能量代谢障碍进一步阻碍低氧暴露造成的神经元发育异常。
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