摘要
目的：重度抑郁症是一种复杂的非器质性精神疾病，具有高患病率、高复发率和高致残率的特征，严重影响患者心理社会功能和生活质量。现有的抗抑郁药物存在个体差异大、副作用大以及受血脑屏障限制等缺点。因此，开发新型抗抑郁药物并安全有效地将其递送至作用部位意义重大。课题组前期研究发现环状RNADYM（circRNADYM，circDYM）参与抑郁症的调节。本研究基于新颖的药物递载系统-细胞外囊泡（extracellularvesicle，EV）靶向脑部递送circDYM，探寻具有临床转化价值的且有效治疗抑郁症的策略。 方法：基于狂犬病毒糖蛋白（rabiesvirusglycoprotein）RVG-Lamp2b脑靶向修饰的技术构建RVG-circDYM-EV，通过透射电镜分析（transmissionelectronmicroscope，TEM）、纳米颗粒追踪分析（nanoparticletrackinganalysis，NTA）、蛋白质免疫印迹（westernblot）、绝对荧光定量（quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）等表征RVG-circDYM-EV；利用活细胞工作站在离体水平上评估小胶质细胞摄取RVG-circDYM-EV情况；应用小动物活体成像系统（nearinfraredfluorescenceimaging，NIRF）以及绝对荧光定量qPCR分析RVG-circDYM-EV在体内分布及递送circDYM的情况；采用CCK8细胞活力检测和流式细胞术（flowcytometry，FCM）评估RVG-circDYM-EV的生物安全性。通过尾静脉向正常小鼠给予不同剂量RVG-circDYM-EV评估RVG-EV靶向脑部递送circDYM情况；通过向慢性不可预知刺激（chronicunpredictablestimulation，CUS）模型小鼠给予RVG-circDYM-EV干预评估其对小鼠抑郁样行为的影响。通过酶联免疫法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）和westernblot分别检测小鼠海马脑区细胞因子（IL-6，IL-1β，MCP-1和TNF-α），诱导性一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）以及胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）的表达水平；通过FCM和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）法结合sholl分析测定小胶质细胞和星形胶质数量以及形态的变化；应用westernblot和伊文思蓝（evansblue，EB）免疫荧光技术评估RVG-circDYM-EV对血脑屏障的影响；通过FCM分析外周免疫细胞浸润中枢神经系统的情况。最后，基于转录组学结合生物信息学，免疫荧光实验，RNA结合蛋白免疫沉淀（RNAbindingproteinimmunoprecipitation，RIP），RNA下拉以及染色质免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）等分子生物学实验，探究circDYM抑制神经炎症缓解抑郁症的分子机制。 结果：工程化构建的RVG-circDYM-EV的粒径集中分布在115.2nm左右；脑靶向RVG-Lamp2b融合蛋白在EV表面表达；circDYM在EV中高表达；RVG-circDYM-EV在体外高效地将circDYM递至小胶质细胞中；RVG-circDYM-EV在体内安全有效地将circDYM靶向递送小鼠脑部并被神经细胞摄取。尾静脉注射RVG-circDYM-EV显著增加小鼠脑区circDYM的表达水平；circDYM在正常小鼠脑部的表达水平随RVG-circDYM-EV剂量增加而升高；RVG-circDYM-EV干预显著改善CUS小鼠抑郁样的行为。细胞机制研究表明，RVG-circDYM-EV显著抑制了CUS小鼠海马脑区的小胶质细胞活化；减少星形胶质细胞丢失；减少血脑屏障损伤；抑制外周免疫细胞（CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞和Ly6G-Ly6Clow细胞）浸润小鼠脑组织。分子机制研究表明，circDYM与转录因子TATA框结合蛋白关联因子1（TATA-boxbindingproteinassociatedfactor1，TAF1）结合，影响TAF1的亚细胞分布，继而抑制TAF1下游的促炎靶基因（Trpm6，Cyp39a1）的转录，从而改善小鼠抑郁样行为。 结论：本研究基于RVG-Lamp2b-EV脑靶向递载系统，靶向脑部递送circDYM，证实了RVG-circDYM-EV能够通过抑制神经炎症有效地缓解小鼠抑郁样行为，解析了核心效应分子-circDYM作用的分子及细胞机制。本研究将为开发有效缓解抑郁症的治疗方案提供基础。
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