摘要
细胞中基因表达受多层面机制调控，例如表观遗传调控、转录后调控及翻译后调控等。肿瘤的发生发展过程通常伴随基因表达调控通路的异常，因此探究肿瘤中基因表达的调控网络对于了解疾病的发生机制以及研发相应的诊疗策略具有重要意义。DNA甲基化和组蛋白修饰是迄今为止最为广泛关注的表观遗传标记，在多种生理与病理过程中发挥重要的调控作用。例如，肿瘤中普遍存在的CpG岛高甲基化现象（CIMP）,该表型可能由DNA甲基转移酶的过表达导致，也可由IDH突变引发的DNA去甲基化反应受阻诱发，脑胶质母细胞瘤（GBM）和急性髓性白血病（AML)中便存在这种现象，然而目前针对高甲基化现象的认识还不够全面。RNA N6-甲基腺嘌呤（m6A）甲基化修饰是哺乳动物mRNA上分布最广泛的一种转录后修饰，其稳态依赖于甲基转移酶复合物以及去甲基化酶的协同作用，其发挥功能则依赖于m6A识别蛋白的介导。迄今为止，已有多项研究指出m6A调控蛋白的异常表达通过影响下游的调控通路参与人体多种疾病的发生，但是目前在胰腺导管腺癌和乳腺癌中的具体研究还比较有限。生物体内的调控网络错综复杂，能够将肿瘤中发生的异常调控进行解析有助于对相应发病机制的理解，从而对临床中的诊断和治疗工作提供前期基础。 GBM不同患者之间甲基化水平存在较高的差异，基于GBM甲基化谱的研究将其分为四种亚型:IDH、MES、RTKⅠ和RTKⅡ。DNA甲基化在GBM的诊断和临床治疗指导方面具有深远的意义，例如MGMT高甲基化患者对替莫唑胺治疗敏感性高。GBM中存在普遍的DNA高甲基化现象，以往的研究只关注到由于IDH突变导致部分CpG岛甲基化水平升高（IDH-CIMP）,除此之外，我们观察到RTKⅡ分型的整体甲基化水平也较高，且鉴定到一类不依赖于IDH突变的异常高甲基化CpG岛（RTK2-CIMP）。针对这部分高甲基化现象的发生机制以及调控靶标的研究有助于进一步了解GBM的发病机制以及研发相应的治疗手段。通过整合分析肿瘤以及神经祖细胞（NP）来源的表观遗传标记测序数据，我们发现肿瘤中的高甲基化与NP细胞中表观修饰存在关联，并且两种类型的CIMP区域表现出不同的特征，RTK2-CIMP区域在NP细胞中具有更高的H3K27me3修饰水平。通过观察CIMP靶基因在正常脑发育过程中不同类型细胞中的表达情况，我们发现RTK2-CIMP靶基因在祖细胞中表达确实受到抑制，并且在神经元分化路径中呈升高趋势，说明该类CIMP在细胞谱系分化过程中通过靶向神经元分化途径来介导RTKⅡ亚型肿瘤的发生。为了证实在GBM中观察到的现象,我们在同样具有不依赖于IDH突变的CIMP现象的AML中验证了A-CIMP区域(RTK2-CIMP)在造血干/祖细胞中存在更高水平的H3K27me3修饰，其靶基因在红细胞分化路径中表达特异性升高。我们的研究揭示了GBM和AML中共同存在的不依赖IDH突变的DNA高甲基化发生与早期祖细胞中H3K27me3修饰紧密相关，并且通过影响特定细胞谱系分化来参与疾病的发生，为该类型肿瘤患者的治疗手段研究提供新思路。由于CIMP表型与临床特征之间的密切关联，所以对肿瘤中CIMP现象的研究对于临床策略的制定以及理解其来源机制和特征具有重要意义。 与GBM相似，乳腺癌也是分子特征具有高度异质性的一种肿瘤，基于基因表达的分型有四种:基底样型、HER2过表达型、管腔A和管腔B型，其中基底样型样本的预后最差、恶性程度最高，管腔型样本预后最好。虽然乳腺癌的分型方式比较成熟，但是在临床表现上依旧存在分型内部不一致的问题。本研究从RNA甲基化层面关注m6A调控因子在乳腺癌中的表现，我们利用TCGA(the Cancer Genome Atlas)公共数据库中多组学数据对这些调控因子在乳腺癌中的变异图谱进行绘制，并且关注不同分型乳腺癌之间的差异。我们发现在恶性程度最高的基底样分型中,m6A调控因子的表达谱及甲基化谱表现出异于其他分型的特征，因此我们猜测m6A调控因子与乳腺癌的恶性程度有一定关联。随后我们利用随机森林模型筛选出基底样分型中的四个特征因子——IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDC2和RBM15，并基于其DNA甲基化谱鉴定出管腔A/B型样本内部的异质性，成功将其分别分为两组，两组样本在患者预后生存情况，细胞粘附相关基因表达以及肿瘤浸润淋巴细胞富集程度方面都表现出显著差异。综上，我们的研究揭示了m6A在乳腺癌发生和发展中潜在的作用，鉴于管腔型样本高度的异质性以及部分病人容易复发的特征，我们的研究也为早期的诊断提供了新思路。 基于m6A在乳腺癌中表现出与肿瘤恶性程度相关的现象,结合我们团队前期利用大量临床样本的免疫组织化学分析发现了m6A去甲基化酶ALKBH5在胰腺导管腺癌中表达显著降低，于是我们猜测m6A在胰腺导管腺癌中也发挥一定影响。为了探究具体的作用机制，我们构建了稳定过表达ALKBH5的胰腺导管腺癌MIAPaCa-2细胞系并进行了m6A-seq,随后通过一系列生物信息学分析逐步锁定下游靶标。进而结合实验手段进行验证，我们发现ALKBH5通过调控m6A水平影响泛素连接酶编码RNA FBXL5和线粒体铁转运蛋白编码RNA SLC25A28的稳定性以及SLC25A37RNA的可变剪接。进一步的结果显示ALKBH5过表达也会引发FBXL5下游底物铁调控蛋白IRP2以及上皮间质转化调控因子SNAI1蛋白水平的改变，从而影响肿瘤细胞内的铁含量以及迁移和侵袭能力。以上结果整体揭示了ALKBH5通过调节铁代谢通路影响胰腺导管腺癌发生发展进程的表观转录机制。 综上，本研究主要关注了肿瘤基因表达调控网络中的两种重要的表观调控模式——DNA甲基化以及RNA m6A甲基化。深入探究了胶质母细胞瘤中DNA高甲基化现象的发生机制，以及RNA甲基化在乳腺癌和胰腺导管腺癌中参与调控的通路，分别为胶质母细胞瘤的靶向治疗、乳腺癌的分型和诊断以及胰腺导管腺癌的靶向治疗提供理论依据，整体的研究为基因转录调控在肿瘤中的作用机制研究和理解提供了新思路。
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