摘要
萱草是国际公认的三大宿根花卉之一，在我国已有三千多年的栽培历史，被称为“母亲花”，具有美好的象征意义。萱草作为园林、园艺领域重要的植物之一，不仅具有观赏价值，而且具有较高的食药价值。然而在萱草的应用中，各种非生物胁迫常常是制约萱草产业发展的重要因素，因此对萱草逆境相关研究具有十分重要的现实意义。‘秋红’是一种二倍体多年生萱草品种，花色艳丽、花朵大且数量多，具有较高观赏价值；‘秋红’具有耐热、耐潮湿和耐干旱等优秀的抗逆特性；‘秋红’能够在绝大多数耐寒区生长且养护要求较低。液泡转化酶是蔗糖转化酶中的一类，在植物蔗糖水解过程中具有重要意义。本研究通过低温胁迫处理和转录组测序找出了可能参与‘秋红’萱草低温胁迫响应的液泡转化酶基因，并进行了生物信息学分析；通过转基因实验验证了HfVIN2基因对低温胁迫的响应；发现一种秆褐霉菌引起的萱草叶枯病及筛选出优选杀菌剂。主要实验结果如下： （1）从‘秋红’萱草转录组数据库中筛选到6个液泡转化酶基因，经PCR扩增及测序验证后，分别命名为HfVIN2~HfVIN7。6条基因的ORF在1767 bp~1944 bp之间，编码的氨基酸个数在588~655之间。6条基因所编码的氨基酸序列间相似性均在70%以上，其中HfVIN2和HfVIN4所编码的氨基酸相似性最高，相似性为99.1%；HfVIN2和HfVIN7的所编码的氨基酸相似性最低，相似性为72.9%。 （2）对获得的液泡转化酶基因序列所编码的蛋白质进行分析，结果表明6个液泡转化酶均为稳定亲水性蛋白，均具有Glyco-32超家族和DUF3357家族。从NCBI中选取不同植物的液泡转化酶基因编码氨基酸序列，构建系统进化树，发现所获得‘秋红’萱草液泡转化酶基因所编码的氨基酸序列均聚在一个分支上，其中HfVIN2与HfVIN3亲缘关系较近，HfVIN4和HfVIN5亲缘关系较近，HfVIN6和HfVIN7亲缘关系较近，同时该分支只包含龙舌兰一个不同物种。利用MEME在线网站对6个液泡转化酶基因编码蛋白序列进行保守基序（Motif）分析，全部序列均识别获得9个保守基序。亚细胞定位表明HfVINs均定位于液泡中。跨膜结构分析显示，HfVIN6和HfVIN7没有跨膜结构，其余成员均具有跨膜结构。蛋白质高级结构预测结果表明，HfVINs蛋白质高级结构具有较高相似性。 （3）对‘秋红’萱草进行低温胁迫胁迫处理，观察记录表型变化，采集处理后的叶片组织进行可溶性蛋白含量和可溶性糖含量测定以及液泡转化酶基因表达荧光定量分析。结果表明，在10℃时，‘秋红’叶片表型特征与15℃（对照温度）时的叶片表型相比未发生明显改变；5℃处理24 h，叶片出现叶尖黄化，叶片颜色加深；0℃处理24 h，叶片出现水渍状的低温损伤现象，叶尖部分开始出现枯萎症状；经过低温胁迫处理后剪去植株地上部分，‘秋红’萱草植株地上部分可以很快长出新叶，复壮情况良好。温度下降过程中可溶性蛋白含量与可溶性糖含量均表现为先下降，后上升。荧光定量分析显示，HfVIN2、HfVIN6、HfVIN7基因相对表达量均随着温度下降而出现上升趋势， HfVIN3、HfVIN4、HfVIN5基因相对表达量表现出先上升后下降的趋势。 （4）对萱草愈伤组织遗传转化体系进行优化，获得了最佳的萱草愈伤组织诱导培养基配方（pH 5.8）：MS 11.74 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L、6-BA 3 mg/L、NAA 2 mg/L，确定了愈伤组织继代次数需少于三次。利用农杆菌介导法将HfVIN2导入到野生型本氏烟草植株中，并进行分化筛选后提取转基因烟草DNA，进行PCR扩增目的片段与阳性对照进行比对。鉴定结果表明，HfVIN2已成功在野生型本氏烟草植株中表达。对转基因烟草低温胁迫处理，发现转基因烟草比野生型烟草表现出更好的抗寒性，推测HfVIN2基因可能是萱草耐冷性的正调控因子。 （5）采集疑似感染叶枯病的‘秋红’萱草叶片，分离得到纯化的病原菌。病原菌菌落呈雪白色放射状，分生孢子梗呈麦穗状，梗上有成串卵圆形或近椭圆形分生孢子，孢子壁黑色，内容物透明，孢子大小约为(3.63~7.27)μm×(3.63~7.27)μm，孢子壁约为1.82μm；根据病原菌ITS序列构建系统进化树，并结合形态学特征，明确该菌株为Limonomyces属真菌秆褐霉菌（Limonomyces culmigenus）。利用百菌清、腐霉利、硫酸铜钙三种杀菌剂进行防治效果研究，其中75%百菌清对秆褐霉菌的半致死浓度（EC50）为 0.1147 mg/L，相较于另两种杀菌剂表现出较强抑制作用；50%腐霉利EC50与77%硫酸铜钙EC50均达到了75%百菌清EC50的30倍以上，表现出中等强度的抑制作用；筛选出百菌清作为优选杀菌剂。
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