摘要
空心莲子草Alternanthera philoxeroid因其具有强大的生命力和繁殖力，已发展为全球性入侵植物，我国将其列为首批重大外来入侵生物之一。莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila因其专一取食空心莲子草，被用作生防昆虫。昆虫的嗅觉在其生长发育过程中发挥着重要作用，气味结合蛋白(Odorant Binding Proteins,OBPs)参与昆虫识别环境信息化合物分子的第一步反应，可与多种寄主植物挥发物结合。然而，OBPs在鞘翅目昆虫莲草直胸跳甲识别环境信息化合物方面的作用目前尚未被全面了解。通过本课题组前期对莲草直胸跳甲触角转录组数据的分析，发现AhygOBP53基因在触角高表达。本文利用基因克隆、系统发育分析、时空表达谱、同源建模、分子对接、蛋白质纯化和荧光竞争性结合实验等技术和方法，系统地研究了4hygOBP53基因的进化和嗅觉功能，得出如下结论: 1.通过基因克隆技术，获得了莲草直胸跳甲OBP53(AhygOBP53)基因的全长,发现其开放阅读框(open reading frame,ORF)为384bp,编码128个氨基酸，分子质量为14.1kD,等电点为4.69,氨基酸序列中含有5个保守的半胱氨酸(Csy)残基，属于Minus-COBPs。系统进化分析表明，AhygOBP53与鞘翅目昆虫大猿叶甲Colaphellus bowringi OBP23(CbowOBP23)聚类在同一支，说明两者的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术，分析了AhygOBP53基因的时空表达谱，发现该基因在成虫阶段的表达量显著高于其他发育阶段，且雌成虫的表达量显著高于雄成虫，在幼虫阶段表达量较低，在卵和蛹中基本不表达;在成虫的不同组织部位，触角的表达量最高，雄性触角显著高于雌性触角。因此，推测AhygOBP53在莲草直胸跳甲对环境信息化合物的识别中起着重要作用。 2.采用同源建模的方法，利用在线软件Swiss-model构建AhygOBP53的三维建模，同时，利用在线软件SAVES提供的Procheck、Verify_3D、ERRAT和Whatcheck四种算法评估了该模型的可靠性。构建的AhygOBP53模型主要由6个α螺旋和无规则卷曲盘绕折叠而成。采用分子对接技术研究了AhygOBP53与空心莲子草98种气味挥发物的结合能力，结果显示与AhygOBP53的结合能小于-5.8kJ/mol的化合物有26种。这表明AhygOBP53能与多种寄主植物挥发物结合。 3.通过原核表达和蛋白纯化，获得了纯净的AhygOBP53蛋白，以N-苯基-1-萘胺(1-NPN)为荧光探针，检测AhygOBP53与空心莲子草20种气味挥发物的结合情况，结果表明，与AhygOBP53具有结合能力的共有10种化合物，分别为:植烷（Ki=58.49）、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯（Ki=50.93）、邻苯二甲酸二乙酯（Ki=39.40）、右旋萜二烯（Ki=31.37）、香叶醇（Ki=25.75）、DMNT（Ki=23.68）、柏木脑（Ki=22.95）、乙酸苯甲酯（Ki=21.27）、苯甲酸叶醇酯（Ki=19.94）、（s）-环己基乙胺（Ki=9.96）。此实验结果与分子对接结果基本一致，说明分子对接技术用于快速筛选AhygOBP53配体的可靠性。 本研究从生物信息学和分子生物学的角度阐述了生防昆虫莲草直胸跳甲气味结合蛋白AhygOBP53基因的嗅觉功能，明确了AhygOBP53的理化性质、进化地位、表达情况以及结合物质，实验结果进一步丰富了莲草直胸跳甲寄主专一性的分子机制相关研究。
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