摘要
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)的流行给整个养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV、TGEV、PoRV都是以呕吐、腹泻和脱水为主要临床特征的疾病，三者均可引起水样腹泻。PCV2也是养猪场流行的一种主要的病原体，新生猪感染后也会出现腹泻症状。目前尚无专门针对这四种病毒的特效治疗方法，临床上主要以预防为主。由于这四种病毒引起的临床症状相似，而且常见猪同时感染其中两种或两种以上的病原体，这给临床现场腹泻类疾病的诊断造成很大困难。因此对这些病毒进行简单、快速、准确的检测对于及时采取适当的防控措施至关重要。所以，本研究以PEDV、TGEV、PoRV和PCV2为研究对象，建立了实时荧光PCR检测方法、可视化LAMP检测方法及手持式可视化微流控芯片多重鉴别诊断技术。主要研究内容和结论如下： (1)开发了基于实时荧光PCR技术的猪四种腹泻病毒的检测方法。基于Taqman探针法实时荧光PCR技术，针对PEDV，TGEV，PoRV和PCV2四种病毒分别合成了4对引物和探针，并在探针5’末端修饰FAM荧光基团，构建了实时荧光PCR反应体系，可以通过FAM通道检测出四种病毒的特异性扩增曲线，四种病毒的基因组灵敏度都可以达到 10copies/μL。该方法可以灵敏快速的对四种猪腹泻病毒进行鉴别诊断，具有操作简便快捷、特异性强、灵敏度高、准确可靠的特点，可以为猪四种腹泻病毒的快速诊断提供依据。 (2)开发了基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的四种腹泻病毒的可视化检测技术，用于未知病料样品中PEDV、TGEV、PoRV和PCV2的检测。使用环介导等温扩增技术，分别以PEDV、TGEV、PoRV和PCV2基因的保守序列为靶标基因，设计LAMP特异性引物序列。该方法特异性强，基因组灵敏度为100copies/μL，该检测方法仅需要一台恒温水浴锅就能完成，避免了热循环仪等设备的使用，而且反应时间短，可以在60分钟左右完成整个扩增反应，结果可由肉眼直接读取，成本大大降低，有助于提高便携化程度，更适合现场检测。 (3)开发了四种腹泻病毒的手持式可视化微流控芯片多重检测技术，进一步提高了腹 泻病毒检测的便携化程度。使用手持式扇形微流控芯片，基于芯片内流体的自身重力在用手甩动时产生的离心力为原理，实现微流体从主通道向反应室的流动和分配，不需要额外的设备为其提供动力。芯片内的反应采用pH指示剂指示反应结果，如果存在目标病毒的DNA，经过芯片LAMP扩增反应后，反应室颜色由反应前的红色变为黄色，如果不存在目标病毒，反应室颜色仍然为红色。该方法仅使用恒温水浴锅在65℃的恒温条件对四种腹泻病毒模板进行特异性扩增，根据肉眼比对反应室颜色的变化就可以判断检测结果，实现了对四种腹泻病毒的同时多重检测，有较强的特异性和重复性，基因组灵敏度可以达到100copies/μL。整个操作过程更加简单便携，可以更好的满足现场检测的需求。
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