摘要
目的： 除手术和化疗外，放疗是治疗实体瘤的主要手段之一。放疗可以很好的控制局部肿瘤的生长并减少肿瘤扩散，但也存在弊端。例如放疗可以通过招募TAMs和MDSCs促进免疫抑制性肿瘤微环境的形成。而肿瘤代谢也可通过消耗关键代谢物(如色氨酸、葡萄糖和谷氨酰胺)和产生抑制性代谢物(如犬尿氨酸)，有利于形成免疫抑制型的肿瘤微环境(TME)。免疫抑制性肿瘤微环境与T细胞耗竭和记忆形成障碍密切相关，也是抗肿瘤免疫治疗的障碍之一。与其他乳腺癌亚型相比，不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)或人表皮生长因子(EGF)受体2 (HER2)的三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer, TNBC)通常表达高水平的ASCT2(一种谷氨酰胺转运体)和谷氨酰胺酶(Glutaminase, GLS)，表现为对谷氨酰胺特别“上瘾”。因此，本研究利用4T1荷瘤小鼠模型，观察靶向谷氨酰胺代谢能否通过抑制T细胞耗竭而改善免疫抑制性肿瘤微环境并提高放疗的敏感性。 方法： 1.抑制谷氨酰胺代谢对小鼠三阴乳腺癌4T1细胞增殖及迁移的影响 1.1 体外常规培养4T1细胞，然后用含有不同浓度GLS抑制剂BPTES的培养基（浓度分别为0μM、1.25μM、2.5μM、5.0μM、10μM、20μM）或含有不同浓度谷氨酰胺的培养基（浓度分别为 0.1mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM）处理24h或48h，经MTS法检测4T1细胞增殖能力。 1.2 用含2.5μM BPTES或0.3 mM 谷氨酰胺的培养基预处理4T1细胞24h，通过划痕实验检测实验组与对照组细胞的迁移能力。 1.3 用含2.5μM BPTES或0.3mM谷氨酰胺预处理4T1细胞24h、48h、72h，收集细胞。WB检测实验组与对照组细胞E-cadherin、N-cadherin的表达情况。 2. 4T1-OVA细胞系的建立 2.1 体外培养293T细胞，将包装质粒pLP-1、pLP-2、pLP-VSVG和目的质粒pCDH-OVA （由南京金斯瑞生物技术有限公司构建）共转染293T细胞。分别在感染后48h和72h ，收集上清，经0.45μM滤器过滤，得到含有OVA病毒颗粒的病毒上清。 2.2 体外培养4T1细胞，在OVA病毒感染4T1细胞24h后，加入嘌呤霉素以筛选阳性细胞。 2.3 MTS法比较4T1细胞与4T1-OVA细胞的增殖能力 2.4 划痕实验比较4T1细胞与4T1-OVA细胞的迁移能力 3. 抑制谷氨酰胺代谢对小鼠T淋巴细胞活性的影响 3.1 用50μg/ml OVA蛋白刺激4T1-OVA荷瘤小鼠脾脏单个核细胞，连续培养5天，制备CTL。实验组T淋巴细胞在培养过程中使用含0.3mM谷氨酰胺的T淋巴细胞培养基，对照组T淋巴细胞在培养过程中使用含2.0mM谷氨酰胺的T淋巴细胞培养基。 3.2 细胞免疫荧光检测实验组与对照组T淋巴细胞中Ki-67的表达情况。 3.3 流式细胞术检测实验组与对照组T淋巴细胞表面CD44、CD62L的表达情况，分析初始T细胞CD62LhiCD44neg/lo 、效应记忆T细胞CD62Lneg/loCD44hi、中央记忆T细胞CD62LhiCD44hi等不同T细胞亚型的分布。 3.4 按照E:T=50：1的比例分别将实验组与对照组CTL与4T1-OVA细胞共培养16h，应用流式细胞术检测两组T淋巴细胞表面CD107a的表达情况。 4. 抑制谷氨酰胺代谢提高X-射线诱导的4T1细胞凋亡及免疫原性 4.1 体外常规培养 4T1 细胞，将其分为对照组、BPTES 处理组（2.5μM,24h）、X-射线照射组（20Gy）、X-射线联合BPTES组。 4.2 继续培养24h后，通过流式细胞仪检测不同处理组4T1肿瘤细胞7-AAD阳性细胞频数或细胞表面MHCⅠ类分子表达情况。 结果： 1. 通过MTS实验确定BPTES的IC50为2.5μM ，谷氨酰胺的IC50为0.3mM。 2. 抑制谷氨酰胺代谢可降低4T1肿瘤细胞的增殖能力（P=0.0014或P=0.0108）及迁移能力（Plt;0.0001）。 3. 通过WB检测E-cadherin、N-cadherin发现，抑制谷氨酰胺代谢可使4T1肿瘤细胞中N-cadherin的表达降低（均为Plt;0.0001），E-cadherin的表达增高（均为Plt;0.0001）。 4. 成功构建4T1-OVA细胞系，经qPCR检测OVA基因表达情况发现，与 4T1 细胞相比， 4T1-OVA 细胞中 OVA 基因表达显著增高（Plt;0.0001）。 5. 4T1细胞与4T1-OVA细胞之间的增殖能力及迁移能力并无显著差异（P=0.0707或P=0.7258）。 6. 细胞免疫荧光结果显示，与对照组相比，低谷氨酰胺处理组（dGln）T细胞中Ki-67表达增强（P=0.0280）。 7. 通过流式细胞术检测不同处理组CTL细胞表面CD44、CD62L的表达情况发现，与对照组相比，低谷氨酰胺处理组（dGln）T细胞中效应记忆T细胞（ CD62Lneg/loCD44hi ）明显增高（ P=0.0043 ） ，初始T细胞（CD62LhiCD44neg/lo）明显降低（P=0.0012），但中央记忆T细胞的比例无明显差异。 8. 按照E:T=50:1 ，将不同处理组的CTL与4T1-OVA细胞共培养16h，流式检测CTL表面CD107a的表达情况，结果显示，与对照组相比，低谷氨酰胺处理组（ dGln ）CTL细胞表面CD107a表达增多（ P=0.0008 ）。 9. 流式细胞术检测4T1肿瘤细胞凋亡情况发现，与对照组相比， BPTES组7-AAD阳性细胞数无明显变化（P=0.8827），但BPTES联合放疗组7-AAD阳性细胞数明显增高（P=0.0027）；与放疗组相比，BPTES联合放疗组7-AAD阳性细胞数也有所增加（P=0.0094）。 10. 流式细胞术检测4T1肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达情况发现，与对照组相比，BPTES组4T1肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达无明显变化（P=0.7027），但BPTES联合放疗组4T1肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达明显增高（P=0.0387）；与放疗组相比，BPTES联合放疗组4T1肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达也有所增加（P=0.0072）。 11. 肿瘤生长曲线结果显示，低剂量和高剂量的BPTES均未能使肿瘤体积发生明显降低；在放疗后的第六天，与对照组相比，放疗组肿瘤体积明显降低（P=0.0483）；与放疗组相比，BPTESlo联合放疗组肿瘤体积也明显降低（P=0.0106）。 12. 肿瘤称重结果显示，与对照组相比，放疗组肿瘤重量明显降低（P=0.0399）；与放疗组相比，BPTESlo联合放疗组肿瘤重量也明显降低（P=0.0034）。 13. 小鼠生存曲线显示，BPTESlo联合放疗可在一定程度延长荷瘤小鼠的生存期。 14. qPCR检测肿瘤组织核心区与周围区颗粒酶B（GZMB）基因表达情况发现，与放疗组相比，BPTESlo联合放疗组肿瘤组织核心区及周围区颗粒酶B基因表达均明显上升（P=0.0038或Plt;0.0001）。 15. 流式检测荷瘤小鼠脾脏MDSC亚型分布情况发现，与放疗组相比， BPTESlo联合放疗组小鼠脾脏组织中G-MDSC比例明显下降（ P=0.0267 ）， M-MDSC比例明显上升（P=0.0239）。 结论： 1. 抑制谷氨酰胺代谢可明显降低小鼠三阴乳腺癌4T1细胞的增殖及迁移能力。 2. 抑制谷氨酰胺代谢可明显提高小鼠CTL的增殖及杀伤能力。 3. 抑制谷氨酰胺代谢可增强X-射线诱导的小鼠三阴乳腺癌4T1细胞的凋亡及免疫原性。 4. 与单独放疗相比，抑制谷氨酰胺代谢联合放疗可有效增强小鼠的抗瘤能力并在一定程度延长荷瘤小鼠的生存期。
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