摘要
目的:本研究主要目的是:(1)探索DHM降血糖的主要作用机制;(2)初步考察了DHM辅助SZ-A降血糖的药效;(3)初步探讨桑叶提取物的降糖活性物质和作用机制。 方法与结果:(1)本研究首先建立了高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的SD大鼠和C57BL/6J小鼠高血糖模型，明确DHM降血糖的药效。首先将6周龄SD大鼠随机分为:对照组(Control)、HFD组、HFD+吡格列酮(PIO)组(5mg/kg PIO)、HFD+100mg/kg DHM组(100mg/kg DHM)、HFD+200mg/kg DHM组(200mg/kg DHM)和HFD+400mg/kg DHM组(400mg/kg DHM)。对照组给予基础饲料，其余组给予高脂饲料。持续灌胃给药8周，在第8周时进行胰岛素耐量实验。结果显示，DHM显著降低了大鼠空腹血糖和胰岛素水平，改善大鼠胰岛素抵抗，降低大鼠血清胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(total triglycerides,TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平,升高血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)水平。(2)本研究将6周龄C57BL/6J小鼠随机分为4组:Control组、DHM组(200mg/kg)、HFD组和HFD+DHM组(200mg/kg)。Control组和DHM组饲喂基础饲料，HFD组和HFD+DHM组饲喂高脂饲料，持续灌胃给药13周。在给药10周进行葡萄糖耐量实验，在给药11周进行胰岛素耐量实验。结果发现，DHM对正常饮食小鼠体重和空腹血糖均没有明显影响，但显著降低了高血糖小鼠体重、空腹血糖、糖化血清蛋白(Glycated serum protein,GSP)和胰岛素水平，减轻高血糖小鼠肝脏脂质积累，改善小鼠葡萄糖和胰岛素耐量，提高小鼠肝脏糖原水平。(3)随后，本研究采用转录组学技术探索DHM降血糖的作用机制。肝脏RNA-seq结果显示，DHM降血糖的作用与“胆汁分泌”密切相关。因此，本研究进一步采用靶向代谢组学的技术对肝脏胆汁酸代谢进行分析。结果发现，HFD诱导了部分胆汁酸，包括甘氨胆酸(glycocholic acid,GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxy cholic Acid,GCDCA)、脱氧胆酸(deoxycholic acid,DC A)和石胆酸(lithocholic acid,LCA)在肝脏中的异常积累，而DHM干预后可明显降低这些胆汁酸的水平。 (4)为了验证这4种胆汁酸与胰岛素抵抗的关系，本研究将上述4种胆汁酸配制成混合胆汁酸溶液(GCA∶GCDCA∶DCA∶LCA=1∶1∶1∶1)分别刺激人肝癌HepG2细胞和人正常肝脏L02细胞。结果发现，25μmol/L混合胆汁酸可以显著抑制胰岛素刺激的肝细胞葡萄糖摄取。分别给予两种肝细胞不同浓度的胆汁酸(GCA/GCDCA/DCA/LCA)单独刺激，发现只有LCA(25μmol/L)可诱导肝细胞产生胰岛素抵抗。本研究进一步给予C57BL/6J小鼠灌胃或腹腔注射1周LCA(125mg/kg),探索LCA在体内是否能够诱导胰岛素抵抗。结果发现，腹腔注射1周LCA后可升高小鼠血糖，引起胰岛素抵抗。(5)随后，采用网络药理学和分子对接挖掘LCA诱导胰岛素抵抗的潜在靶点并用qPCR方法进行了验证，发现LCA诱导的胰岛素抵抗与胆汁酸和脂质代谢密切相关，其中法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)、小异二聚体伴侣(small heterodimer partner,SHP)、过氧化物酶体增殖物活化受体α和γ(peroxisome proliferator-activated receptor-alpha and-gamma,PPARαand PPARγ)发挥着重要作用，而SHP在LCA诱导的胰岛素抵抗中起到关键作用。(6)为了探索SHP在LCA诱导的胰岛素抵抗中的作用，本研究在体外肝细胞中检测LCA处理对SHP表达的影响，发现LCA可诱导肝细胞中SHP基因及蛋白表达。本研究通过转染SHP-Cas9质粒在L02细胞上敲低SHP,发现SHP敲低后LCA不能诱导胰岛素抵抗。而利用PCMV6-SHP质粒在L02细胞中过表达SHP,发现SHP过表达后细胞产生胰岛素抵抗。这些结果表明SHP是LCA诱导胰岛素抵抗所必需的。(7)随后，我们将LCA与SHP进行分子对接，发现LCA与SHP具有很好的结合，结合位点分布在SHP活性口袋的N端，而DHM与SHP也具有结合活性，其结合位点主要分布在SHP的C端。因此，本研究在体外分别表达SHPN端和C端融合蛋白，并通过表面等离子共振(SPR)技术验证了LCA和DHM与SHP N端和C端融合蛋白的结合活性。本研究进一步通过RNA-seq、ChIP-seq以及将两种数据联合分析，发现了与SHP具有相互作用的两个核受体PPARα和PPARγ,且过表达SHP,能显著提高PPARG基因表达，并显著抑制PPARA基因表达。另外，本研究在肝脏中进行验证发现，DHM可显著抑制HFD诱导的肝脏中Nr0b2的表达，上调Ppara及其靶基因Cpt1α的表达，显著抑制Pparg及其靶基因Cd36、Fabp4和Scd1的表达，即DHM通过SHP/PPARα/γ通路增加肝脏脂质消耗、抑制肝脏脂质积累起到降血糖作用。(8)基于上述研究结果，本研究以HFD诱导的高血糖小鼠为模型探讨DHM辅助SZ-A降血糖的作用。分别给予HFD饲喂的小鼠灌胃DHM(200mg/kg)、SZ-A(200mg/kg)、DHM+SZ-A100(100mg/kg DHM+100mg/kg SZ-A)和DHM+SZ-A200(200mg/kg DHM+200mg/kg SZ-A)进行干预，持续灌胃给药15周。在第12周时进行胰岛素耐量实验，在第15周进行葡萄糖耐量实验。结果显示，DHM辅助SZ-A在降低药物剂量的情况下仍显著降低高血糖小鼠空腹血糖、GSP和胰岛素水平，改善其胰岛素和葡萄糖耐量。且DHM+SZ-A100组GSP和胰岛素水平显著低于SZ-A组，这与DHM辅助SZ-A干预后抑制肝脏中PPARγ及其下游靶点，以及抑制活化转录因子3(activating transcription factor3,Atf3)的表达有关。此外，SZ-A及DHM辅助SZ-A均明显降低体重、附睾脂肪组织和皮下脂肪组织重量，降低血清LDL和肝脏TG水平，改善肝脏脂肪变性。HFD升高了小鼠血清中与摄食和能量消耗相关的因子生长分化因子15(growth differentiation factor15,GDF15)、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21,FGF21)水平。而DHM、SZ-A、DHM+SZ-A100和DHM+SZ-A200干预后均显著逆转了这一变化。SZ-A及DHM辅助SZ-A的这些作用与其抑制肝脏中脂质生成相关基因(Pparg、Dgat2、Hmgcr和Acat2的表达)的表达，提高脂肪酸氧化相关基因Ehhadh的表达相关。(9)最后，本研究以T2DM动物模型ob/ob小鼠为研究对象，初步探讨了桑叶提取物(Mulberry leaf extract,MLE)的降糖效果。本研究给予ob/ob小鼠灌胃MLE(80mg/kg)进行干预，持续14周。阳性药为SZ-A(50mg/kg)。本研究结果表明MLE可改善ob/ob小鼠胰岛素抵抗和葡萄糖耐量，降低小鼠血糖。利用网络药理学挖掘MLE抗T2DM的活性化合物和潜在靶点。通过分子对接和胰岛素抵抗细胞模型验证关键化合物的降糖活性和潜在靶点的基因表达。本研究发现MLE显著抑制肝脏中腺苷A1受体（adenosine A1receptor,Adoral）基因的表达。桑酮C、桑辛素和Morusyunnansin L可能是MLE的重要活性成分，分别通过靶向脂质代谢（PPARγ和ADORA1）和胰岛素信号传导（AKT1和GSK3β）发挥降糖作用。 结论:（1）DHM可以抑制HFD诱导的肝脏部分胆汁酸积累，其中最重要的是LCA,能够抑制LCA诱导的胰岛素抵抗和高血糖，这主要是通过抑制SHP的表达，进而调节PPARα、PPARγ及下游靶基因实现的。（2）DHM辅助SZ-A可以减少SZ-A的用量，但又能达到与SZ-A原来剂量相同的降糖和抑制肥胖的效果,且在改善某些指标（GSP和胰岛素）方面优于SZ-A。（3）DHM辅助SZ-A干预后，不仅能抑制肝脏中PPARγ通路，还可抑制Atf3的表达起到降血糖的作用。（4）SZ-A具有降脂减肥的作用，通过抑制肝脏脂质生成减轻肝脏脂质积累，通过增强GDF15、GLP-1和FGF21敏感性抑制食欲。（5）MLE能够降低ob/ob小鼠血糖，主要活性成分包括桑酮C、桑辛素和Morusyunnansin L。
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