摘要
硒(Se)是生命体中一种必需的微量元素。自然界中，硒元素的存在价态有四种，分别是-II、0、IV和VI。环境中的微生物参与了这四种价态之间的相互转化。其中，许多细菌能还原高毒性的亚硒酸盐[Se(IV)]形成低毒性的生物单质硒纳米颗粒。而且，产生的生物单质硒纳米颗粒在抗氧化、抗癌细胞、生物感应器和环境修复等方面有广阔的应用前景。但是，目前关于细菌在好氧条件下还原亚硒酸盐产生单质硒纳米颗粒的分子机制还不清楚。因此，阐明其分子机制是非常重要的。 本研究以一株能在好氧条件下还原亚硒酸盐形成单质硒纳米颗粒的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni) S44为研究对象。通过细胞全蛋白质非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合体外亚硒酸盐还原活性检测，利用质谱分析技术，寻找到了潜在的几种氧化还原酶，其中基因1962单交换突变株亚硒酸盐还原能力显著下降。生物信息学分析表明，蛋白质1962是一种位于周质的亚硫酸盐氧化酶家族的氧化还原酶，含有钼辅因子，负责电子传递的特异性细胞色素蛋白与其组成异二聚体。为了体内鉴定蛋白质1962的功能，本研究首先构建了S44-?1962突变株和S44-?1962-C互补株。野生株、突变株和互补株的生长一致，突变株还原0.5 mM亚硒酸盐的能力相比野生株在64小时内下降75%，互补株还原能力完全恢复。其次，构建了大肠杆菌W3110异源超表达株W3110::1962，超表达菌株和野生株生长基本一致，超表达菌株的还原能力显著提升40%。随后，为了鉴定蛋白质1962的功能，异源表达纯化了蛋白1962。体外实验结果表明，蛋白质1962具有亚硒酸盐还原酶活性，其亲和常数Km为180 ±5 μmol，最大反应速率为61±2 nmol min-1 mg-1。最后，为了鉴定基因1962下游的细胞色素蛋白基因ccp是否是其特异性的细胞色素蛋白，构建了同源超表达菌株S44::(1962+ccp)，进行了基因1962和ccp的共转录实验，结果表明，超表达菌株亚硒酸盐还原能力相比野生株未明显加强，且基因1962和ccp不是共转录。综上所述，通过体内和体外实验首次发现并证实了一种位于细胞周质的含有钼的氧化还原酶1962具有亚硒酸盐还原活性，它参与了好氧细菌S44亚硒酸盐的还原。该亚硒酸盐还原酶的研究为今后治理硒污染和人工合成生物纳米硒颗粒奠定了基础。 本研究还对采集自湖北恩施大峡谷云龙河地缝崖壁的土壤中的微生物进行分离，得到了一株菌株YLT33T，通过多相分类学鉴定其为Sphingoaurantiacus属的新种，命名为Sphingoaurantiacus capsulatus sp.nov., 模式菌株为YLT33T (=KCTC 42644T=CCTCC AB 2015150T)。这种能代谢产生类胡萝卜素的细菌可以为工业生产上构建类胡萝卜素高产工程菌提供基因和菌种资源。
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