摘要
低氧适应对心脏有保护作用，提高心肌细胞的低氧适应性对动物有效预防心肌损伤和改善心脏功能具有重要意义。花青素具有良好的抗氧化活性，可有效缓解缺氧引起的心肌细胞凋亡和心肌损伤。本试验拟通过体外构建H9c2大鼠心肌细胞低氧模型，设常氧、低氧和低氧+黑果枸杞花青素（Lycium ruthenicum Murry anthocyanins，LRMA）组。通过CCK-8法检测细胞活率并筛选低氧条件下LRMA的最佳诱导浓度和时间、酶标仪检测乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase，LDH）含量、正常光源下观察细胞形态学变化。通过荧光酶标仪检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的含量、Hoechst33342/PI双染和流式细胞术检测H9c2大鼠心肌细胞凋亡、qRT-PCR和Western blot法检测B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）和Bcl2相关蛋白（Bcl2-Associated X，Bax）的mRNA和蛋白表达。利用RNA-seq技术和生物信息学技术构建LRMA参与的H9c2大鼠心肌细胞低氧适应相关lncRNAs-miRNAs-mRNAs内源竞争RNA（Competing endogenous RNAs，ceRNA）调控网络。流式细胞术检测H9c2大鼠心肌细胞的周期分布并分别通过qRT-PCR和Western blot法检测细胞周期蛋白T2（Cyclin T2，CCNT2）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase9，CDK9）和叉头框蛋白P1（Forkhead box P1，FOXP1）的mRNA和蛋白表达，探究LRMA在低氧条件下对H9c2大鼠心肌细胞的保护机制，以期为哺乳动物在低氧环境下的适应性研究喝开发LRMA作为饲料添加剂提高高原动物低氧适应性奠定基础。 主要研究内容和结果如下： 1.LRMA对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞的保护作用 CCK-8结果发现，LRMA在低氧条件下可有效提高H9c2大鼠心肌细胞活率，并筛选出LRMA在低氧条件下最佳诱导方案为：50μg/mL LRMA预处理12h，而后细胞置于低氧+LRMA条件下继续诱导24h。因此后续试验采用此浓度和时间对细胞进行处理。LDH和细胞形态检测结果发现，与常氧组相比，低氧组LDH活性极显著升高（P＜0.01），细胞密度降低，细胞缩小，细胞边界模糊，呈现凋亡和坏死形态；与低氧组相比，低氧+LRMA组LDH活性显著降低（P＜0.05），细胞密度升高，细胞边界清晰，细胞形态相对正常。结果表明，LRMA对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞具有保护作用。 2.LRMA对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞凋亡的影响 凋亡检测结果显示：与常氧组相比，低氧组细胞兰色和红色荧光强度明显增强，ROS含量和凋亡率极显著升高（P＜0.01），Bax的mRNA和蛋白表达极显著升高（P＜0.01），Bcl2、Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表达均极显著降低（P＜0.01）。与低氧组相比，低氧+LRMA组细胞兰色和红色荧光强度显著降低，ROS含量和凋亡率极显著降低（P＜0.01），Bax的mRNA和蛋白表达极显著降低（P＜0.01），Bcl2、Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表达极显著升高（P＜0.01）。结果表明，LRMA可有效抑制低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞凋亡。 3.LRMA参与调控的低氧相关ceRNA调控网络构建 通过生物学信息分析发现，受低氧调控的差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)共有1404个、微小RNA（microRNA，miRNA）共有20个、mRNA共有829个。在低氧条件下，我们获得了LRMA参与调控的相关差异表达lncRNA共有1769个、miRNA共有62个、mRNA共有2517个。以上两者取交集获得LRMA参与调控的低氧相关差异表达lncRNA862个，miRNA7个，mRNA351个。在对LRMA参与调控的低氧相关差异基因的功能富集分析中发现，相关差异基因主要富集在与细胞增殖分裂、细胞能量代谢、炎症反应和细胞发育等相关的通路上。ceRNA网络分析共获得8个lncRNA-miRNA关系对，33个miRNA-mRNA关系对，最终筛选得到5对ceRNA。此外，5对ceRNA中，CCNT2和FOXP1的富集程度较高。qRT-PCR表达趋势验证结果与测序结果表达趋势一致，表明测序结果真实可靠。 4.LRMA对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞增殖的影响 根据全转录组结果发现，LRMA保护H9c2大鼠心肌细胞的低氧增殖活性可能与CCNT2和FOXP1的表达有关。通过进一步研究，流式细胞术检测细胞周期结果发现，与常氧组相比，低氧组G0/G1期细胞数显著增加（P＜0.05），S期和G2/M期细胞数显著降低（P＜0.05），CCNT2、CDK9和FOXP1的mRNA和蛋白表达均极显著降低（P＜0.01）。与低氧组相比，低氧+LRMA组G0/G1期细胞数显著降低（P＜0.05），S期和G2/M期细胞数均显著升高（P＜0.05），CCNT2、CDK9和FOXP1的mRNA和蛋白表达均极显著升高（P＜0.01）。结果表明，LRMA可通过促进H9c2大鼠心肌细胞增殖，进而提高H9c2大鼠心肌细胞低氧适应性，从而发挥对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞的保护作用。
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