摘要
目的：探讨前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type9，PCSK9)通过调控血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）铁死亡促As斑块不稳定的作用及机制。 方法： （1）取人动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）斑块，采用免疫组织化学方法检测 PCSK9 在人 As 稳定斑块与不稳定斑块中的表达分布情况。免疫荧光双标技术检测 PCSK9 在人 As 稳定斑块与不稳定斑块VSMCs中的共定位情况。 （2）选取8~10周龄雄性PCSK9flox/flox小鼠和PCSK9SMC OE小鼠各10只，适应性喂养1 W后，进行单次尾静脉AAV8-D377Y-mPCSK9注射，两组小鼠予以高脂高胆固醇饮食喂养，12W后处死动物。利用RT-PCR和Western blotting检测PCSK9在两组小鼠主动脉组织中表达；免疫荧光检测小鼠见动脉组织中PCSK9表达情况；masson染色检测的主动脉窦As斑块的胶原纤维情况，免疫组织化学染色检测主动脉窦As斑块巨噬细胞标志物CD68和VSMCs标志物α-SMA的表达情况，计算斑块不稳定指数。 （3）免疫荧光双标检测PCSK9SMC OE小鼠斑块VSMCs中GPX4、PTGS2的表达情况及其共定位情况；DAB增强的普鲁士蓝染色检测PCSK9SMC OE小鼠As斑块中铁离子沉积情况。免疫组化检测4-HNE含量。 （4）采用免疫荧光双标技术检测GPX4、PTGS2在人As稳定斑块与不稳定斑块中的表达分布情况以及与斑块 VSMCs 的共定位情况；普鲁士蓝染色检测稳定斑块与不稳定斑块的铁离子沉积情况。将8周龄ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养12周，同时腹腔注射或不注射铁死亡抑制剂Fer-1 12周，采用免疫荧光分别检测铁死亡相关蛋白GPX4和PTGS2的表达情况；采用免疫组化检测脂质过氧化物4-HNE含量；免疫组织化学染色检测头臂干 As 斑块巨噬细胞标志物 CD68 和VSMCs 标志物 α-SMA 的表达情况，masson 染色观察胶原含量；计算As斑块不稳定指数。 （5）以PCSK9过表达腺病毒转染小鼠原代VSMCs，采用CCK-8法检测细胞活力情况；荧光探针检测细胞内铁离子，ROS含量；检测细胞内脂质过氧化物MDA的含量；检测细胞内氧化还原物谷胱甘肽（GSH）的含量；Western blotting检测GPX4, PTGS2的表达情况。 （6）对过表达PCSK9的小鼠原代VSMCs进行转录组测序，结合FerrDb铁死亡数据库进行生物信息学分析及Western blotting验证。 （7）采用线粒体活性氧探针MitoSOX检测活细胞内线粒体活性氧（mtROS）含量; 采用 TMRE 荧光探针检测活细胞内线粒体膜电位(MMP)的变化;采用qPCR检测小鼠VSMCs线粒体中受损mtDNA含量。 结果：（1）免疫组化与免疫荧光双标检测结果显示，与稳定 As 斑块VSMCs 相比，PCSK9在不稳定 As 斑块 VSMCs 中呈高表达。 (2)RT-PCR（P＜0.001）和Western blotting（P＜0.01）检测结果表明，PCSK9SMC OE小鼠主动脉VSMCs中PCSK9表达明显增加；免疫荧光结果显示PCSK9SMC OE小鼠颈动脉组织中PCSK9高表达；masson染色结果显示，PCSK9SMC OE小鼠主动脉窦斑块的胶原纤维含量减少（P＜0.05），坏死核心区域增加（P＜0.01）；免疫组化结果显示CD68阳性区域增多（P＜0.05），α-SMA阳性区域减少（P＜0.01）；主动脉窦As斑块不稳定指数增高（P＜0.01）。 （3）免疫荧光双标显示PCSK9SMC OE小鼠斑块VSMCs中GPX4表达减少、PTGS2 的表达增高， DAB 增强的普鲁士蓝染色表明PCSK9SMC OE小鼠斑块铁离子沉积增加，免疫组化显示PCSK9SMC OE小鼠斑块4-HNE含量增加。 （4）免疫荧光结果显示，与人稳定斑块相比，人不稳定斑块VSMCs中GPX4表达下调，PTGS2上调。免疫荧光结果显示与ApoE-/-小鼠相比，Fer-1组小鼠的GPX4的表达上调，PTGS2的表达下调；免疫组化结果显示，Fer-1组4-HNE含量减少。Fer-1组小鼠masson染色结果表明，Fer-1可增加As小鼠头臂干斑块的胶原纤维含量（P＜0.05），减小斑块坏死核心大小（P＜0.01）；免疫组化结果显示Fer-1组小鼠头臂干斑块CD68阳性区域减少（P＜0.05），α-SMA阳性区域增多（P＜0.01）；As斑块不稳定指数下降（P＜0.05）。 （5）与对照组相比，过表达 PCSK9 组细胞活力下降（P＜0.05）；细胞内 ROS 和 MDA（P＜0.01）的水平增加，GSH 水平减少（P＜0.05）；Western blotting结果显示，过表达组GPX4的表达减少（P＜0.01），同时PTGS2的表达增加（P＜0.05）。 （6）结果发现，PCSK9过表达差异基因信号通路集中于线粒体自噬与p53信号通路；将铁死亡相关差异基因与线粒体相关基因取交集得到19个铁死亡线粒体相关基因，其中GLS2为上调最明显的基因；Western blotting实验表明过表达PCSK9可上调小鼠原代VSMCs中p53, GLS2的蛋白质表达（P＜0.05）。 （7）结果显示，过表达 PCSK9 可增加细胞内 mtROS 含量（P＜0.01），降低线粒体膜电位水平（P＜0.001），使线粒体DNA受损断裂（P＜0.05）。 结论：PCSK9可介导VSMCs铁死亡促小鼠As斑块不稳定，其作用机制与上调p53、GLS2，引起线粒体功能受损有关。
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