摘要
细菌处于一个高度密集且充满竞争的环境中，为了获得更多的空间与资源以取得生存优势，细菌进化出了多种工具及“武器”，其中病原菌能通过引起宿主细胞发生病变的方式来占据生存优势。通常将病原菌能够引起宿主细胞病变的特性称为致病性，而病原菌的致病性则是由其携带的毒力因子(Virulence factor,VF)决定的。VF是病原菌编码的各种能够促进其在宿主环境中黏附、侵袭、增殖、播散和造成宿主损伤的基因产物的统称。VF通常可以分为细菌毒素、黏附蛋白、侵袭因子、分泌系统等多种类型。而分泌系统是VF中非常重要的一类，它们常常需要通过分泌效应蛋白(Effector)进入到宿主细胞或环境中来发挥作用。基于分泌系统分泌效应蛋白的不同机制，分泌系统目前可被分为九种类型(Ⅰ-Ⅸ型)，其中Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion system,T6SS)是一类结构复杂、分布广泛的接触依赖型分泌系统,也是近年来细菌致病机制研究的热点之一。T6SS分泌的效应蛋白不仅能作用于原核生物，而且也能对真核细胞产生损伤。因此，探究T6SS的作用机制对于阐明病原菌致病机理具有重要意义。 前期研究表明，即使同一种株细菌中的T6SS也能够分泌不同的效应蛋白来发挥不同的作用。T6SS的效应蛋白可以分为“货物型”效应蛋白(Cargo effectors)和“特化型”效应蛋白(Specialized effectors),其中部分“货物型”效应蛋白的分泌过程中需要在一些具有辅助功能的蛋白协助下才能顺利进行。目前发现的辅助蛋白可以分为伴侣蛋白(Chaperone/Adaptor)和协同效应蛋白(Cooperate effector,co-effector)两类。这两者之间的区别在于，当效应蛋白被分泌至细胞外时，伴侣蛋白会与效应蛋白脱离，留在细胞内，而协同效应蛋白则会随效应蛋白一起被分泌至细胞外。目前已知的伴侣蛋白包括DUF2169、DUF4123和DUF1795三种蛋白家族，而协同效应蛋白只报道了MIX(Marker for type six effectors)一种蛋白家族。因此，本课题尝试通过基因组大数据挖掘，探究T6SS是否存在其他更多种类的协同效应蛋白家族，从而揭示它们的分布特征。 根据已知的伴侣蛋白和协同效应蛋白的分布规律，我们发现这些辅助蛋白通常编码于缬氨酸-甘氨酸重复G蛋白(Valine-glycine repeat G,VgrG)下游的同一操纵子内，因此本研究以VgrG下游操纵子作为切入点。首先，通过对源自公共数据库的133,722个细菌基因组序列(包括完整基因组和基因组草图)的高通量筛选，我们得到了由45,041个革兰氏阴性菌基因组编码的130,825个VgrG蛋白构成的VgrG蛋白数据集。在利用进化分析验证VgrG蛋白数据集后，通过研究MIX蛋白家族在基因组中的编码位置规律，我们针对VgrG数据集设立了相应的筛选策略，将位于vgrG基因下游操纵子中与潜在效应蛋白编码基因之间的所有已知蛋白家族进行了系统筛选和统计分析，从中发现了DUF2345、FIX-like、LysM、5、PG_binding_1和PHA00368等六种T6SS潜在的协同效应蛋白家族。 进一步的分析表明，6种新发现的协同效应蛋白家族与MIX编码规律相似，它们既可以编码于T6SS的效应蛋白编码基因的N末端或vgrG基因的C末端，也可以由位于vgrG和下游效应蛋白编码基因之间的单独基因编码。随后，我们的合作者通过实验证明，DUF2345和LysM蛋白家族成员确实能够辅助VgrG蛋白与其相应效应蛋白之间的相互作用，并且对于T6SS效应蛋白的分泌至关重要。同时，本研究新发现的六种协同效应蛋白与MIX相似，均广泛分布于不同种类的革兰氏阴性菌中，并且与其下游编码的效应蛋白存在着一定的关联性特征。统计表明，在本研究收集的130,825个VgrG蛋白构成的数据集中，下游编码至少一种协同效应蛋白的VgrG约有68.01％,说明协同效应蛋白的辅助作用可能是T6SS发挥作用的一种普遍机制。为了方便后续研究分析，我们将本研究收集的VgrG数据集进行了整合与可视化展示，构建了VgrG数据库dbVgrG(http://www.mgc.ac.cn/dbVgrG)。 综上所述，本课题通过对公共数据库的细菌基因组大数据的过滤、筛选和挖掘，发现了包括DUF2345、FIX-like、LysM、5、PG_binding_1和PHA00368等六种新的潜在协同效应蛋白家族，进一步拓展了当前对于T6SS协同效应蛋白的研究范围，初步揭示了协同效应蛋白的广泛分布特征，提示其可能是T6SS的一种普遍特性。并且发现了协同效应蛋白与其下游效应蛋白可能存在着一定的关联性特征,为将这些协同效应蛋白作为标记进一步发现潜在的未知T6SS效应蛋白提供了线索。同时，本研究构建了包含130,825个VgrG的开放数据库，为后续深入开展协同效应蛋白、伴侣蛋白、免疫蛋白及效应蛋白等的相关机制研究提供了良好的数据基础。
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