摘要
本研究主要分为两部分，第一部分为嗜热四膜虫核酶RNA高效环化系统的建立及应用研究，第二部分为新型MDM2抑制剂抗肿瘤作用评价与机制研究，分别从circRNA和小分子抑制剂两个角度来进行肿瘤分子治疗方式的研究。 第一部分 基于嗜热四膜虫核酶的RNA高效环化系统的建立及应用研究 目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类由前体mRNA通过反向剪接产生，具有共价闭合环状结构的RNA分子，可以应用于疾病的诊断和治疗。但由于天然circRNA在组织和细胞中的表达丰度较低，目前缺乏高效、准确、简便的过表达circRNA工具，许多circRNA的生物学功能没有得到广泛的研究，这限制了 circRNA的广泛应用。通常，在体外合成circRNA主要有三种方法:化学合成法，T4RNA/DNA连接酶连接法和基于Ⅰ组内含子核酶剪接活性的“排列内含子-外显子(permuted intron-exon,PIE)”策略。目前，在细胞内合成circRNA的通用方法是侧翼内含子互补序列(intronic complementary sequence,ICS)介导成环的方法。经典侧翼ICS介导成环的过表达质粒可以直接转染入细胞来过表达circRNA。然而，这些合成circRNA的方法存在一些问题，例如PIE方法生成的circRNA中会不可避免地引入额外的外源核苷酸。而侧翼ICS介导成环的过表达circRNA质粒由于较低的环化效率会在细胞内引入大量线性转录本，这些线性转录本可能会干扰circRNA在细胞内功能的研究。嗜热四膜虫Ⅰ组内含子已被证明是一种被广泛应用的核酶，可用于RNA和DNA的内部剪接、RNA融合和基因传递等反应。本研究开发了一种利用嗜热四膜虫核酶催化活性的RNA环化系统，在哺乳动物细胞内或体外均能高效准确地合成circRNA。 方法:将目标RNA环化序列克隆入优化后的嗜热四膜虫核酶片段下游，并在核酶上游的pCDH载体骨架上添加一段与环化RNA序列下游载体序列互补的反义区，建立基于嗜热四膜虫核酶的新型RNA环化系统。基于上述系统构建过表达circDnmt1质粒，对合成circDnmt1的剪接位点、表达水平和剪接效率进行分析。在此基础上，利用本研究中嗜热四膜虫核酶新型RNA环化系统和侧翼ICS介导成环两种方法构建了三种被多种研究证明具有生物学功能的长序列circRNA——CDR1as、circFOXO3和circHIPK3的过表达质粒进行过表达水平的比较，并进一步分析了本系统过表达的CDR1as和circFOXO3在细胞中的生物学功能。最后，本研究设计并构建了一种circRNA蛋白表达报告基因系统，其中RNA环化序列包括两段截断的以相反顺序排列的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)序列和用来驱动非帽依赖性翻译的CVB3 IRES序列。该系统可以通过反向剪接产生能够编码GFP的环状序列，本研究对其剪接位点、剪接效率和GFP荧光水平进行检测。 结果:本研究提出了一种基于嗜热四膜虫核酶催化活性的circRNA合成策略。使用该策略，可以在体外和哺乳动物细胞内合成目标circRNA和实现对天然内源性circRNA序列的完美模拟并且保留其原始的生物学功能。qRT-PCR实验结果表明，该方法合成circDnmt1的环化效率可达80％并且可以在多种细胞如HEK293T、HeLa和MCF7中达到较高的表达水平。进一步研究发现，嗜热四膜虫核酶RNA环化系统过表达的circDnmt1、CDR1as、circFOXO3和circHIPK3比侧翼ICS介导成环方法过表达的circDnmt1、CDR1as、circFOXO3和circHIPK3具有更高的过表达水平，并且本系统过表达的CDR1as回复miR-7在结肠癌细胞中的抑癌作用，circFOXO3保留了天然circFOXO3在调节前列腺癌细胞增殖、迁移和凋亡方面的生物学功能。CircRNA蛋白表达系统产生的编码GFP环化序列的剪接效率高于对照组，由此产生的完整GFP开放阅读框(open reading frame,ORF)可以翻译GFP,显微镜下可见绿色荧光。 结论:本研究成功建立了一种基于嗜热四膜虫核酶高效剪接活性的RNA环化策略，可以高效地产生circRNA,并且不会引入任何额外的外源序列。本研究为circRNA在哺乳动物细胞内和体外合成提供了一种高效、准确、简便的策略，并且该RNA环化系统也可以通过引入内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的方式驱动circRNA编码蛋白质，这为circRNA成为有效安全的RNA治疗平台和替代mRNA稳定表达蛋白质提供了强有力的技术支持。 第二部分 新型MDM2抑制剂抗肿瘤作用评价与机制研究 目的:由肿瘤抑制基因TP53编码的蛋白p53是一种能够调控细胞分化，DNA修复，细胞周期和细胞凋亡等过程的转录因子。p53蛋白的失活与细胞异常增殖以及肿瘤发生发展密切相关。一般来说，P53蛋白与其它蛋白的相互作用，TP53基因突变，都可以导致野生型p53功能的丧失。MDM2是p53的关键负调控因子之一，通过抑制MDM2-p53相互作用来激活p53是一种很有前景的癌症治疗选择。MDM2抑制剂通过阻断MDM2对野生型p53的降解作用，可以提高肿瘤细胞内野生型p53的蛋白水平，增强其抑癌功能。虽然目前一些MDM2抑制剂正在血液恶性肿瘤和实体瘤治疗的临床试验中进行测试，但包括血液毒性和胃肠道不良反应等不可忽视的副作用问题限制了该类药物的快速获批。通过蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera,PROTAC)策略，近年来设计了一些靶向 MDM2的异双功能PROTAC,显示出强大的MDM2抑制活性。 方法:本课题组之前报道了一种聚乙二醇化螺环-吲哚酮类MDM2抑制剂。为了开发更有效、脱靶毒性更低的MDM2抑制剂，基于之前的工作基础，本研究合成了一种具有强效MDM2-p53抑制活性的新型螺环-吲哚酮类MDM2抑制剂XR-4。Western blot和qRT-PCR检测XR-4对不同肿瘤中 MDM2和p53蛋白水平及p53下游靶基因水平的影响。CCK8实验和克隆形成实验检测XR-4对细胞增殖能力和克隆形成活性的影响。 结果:XR-4作为一种有效的MDM2抑制剂，可以通过竞争性结合p53结合MDM2的结合位点，促进野生型p53在肿瘤细胞中的积累，激活p53下游靶基因P21和PUMA的水平，进而抑制肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。XR-4也可以看作是homo-PROTAC分子，由2个相同的E3连接酶MDM2靶向配体组成，在不增加额外靶点的情况下诱导MDM2蛋白自降解使表达水平下调，减少可能的副作用。XR-4在广谱p53野生型癌细胞包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌和结肠癌中与RG7388显示出相当的肿瘤细胞增殖抑制活性和较低的脱靶毒性。 结论:XR-4是一种有效的二聚体螺环吲哚酮类新型MDM2抑制剂，具有p53激活活性和肿瘤抑制活性。
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