摘要
米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）可感染多种养殖和野生蛙类，引起蛙类“歪头病”，该病传染性强、死亡率高，对我国蛙类养殖业造成了巨大的经济损失，目前尚无稳定有效的防治方法。因此，亟需开展 E. miricola 致病机理的相关研究，挖掘 E. miricola 重要的毒力因子，解析其致病功能，为“歪头病”防控药物和弱毒疫苗的研发提供理论依据。外膜蛋白 A（Outer membrane protein A，OmpA）是细菌重要的毒力因子，能够维持细菌结构稳定，调控细菌生理代谢，影响细菌致病性，然而 OmpA 在 E. miricola 中的作用还未知。本研究以 E. miricola FL160902 为研究对象，利用同源重组法构建了 ompA 基因缺失株，通过分析 ompA 基因缺失株的生物学特性及其致病性，研究 ompA 在 E. miricola 中的功能。主要研究结果和结论如下： 一，利用同源重组法构建了 5 株 E. miricola ompA 基因缺失株。通过同源比对，在 E. miricola FL160902 基因组中注释到 5 个不同的 ompA 基因，分别为 ompA-0703、ompA-2506、ompA-2507、ompA-3180和ompA-3488。通过 PCR 扩增 ompA 基因左右同源臂和壮观霉素抗性基因片段，连接到自杀质粒 pRE112 上，以含有重组质粒 pRE112-ompA-LSR 的 E. coli S17-1 为供体菌，E. miricola FL160902 为受体菌，进行接合转移，成功构建了 5 株 ompA 基因缺失株。建立了 E. miricola 基因敲除的技术平台，为 E. miricola 基因功能的研究提供了技术手段。 二，通过分析 E. miricola ompA 基因缺失株的生长特性、氧化耐受性和生物膜形成能力，研究了 ompA 基因的基本生物学功能。生长特性实验表明，5 株缺失株的生长速度与野生株基本一致；比较缺失株和野生株对不同浓度 H2O2 的耐受性，发现缺失株 △ompA-3488 的抗氧化能力较野生株显著降低（P＜0.05），表明 ompA-3488 基因响应氧化胁迫；通过结晶紫法测定生物膜形成能力，发现缺失株△ompA-0703 （P＜0.001）、△ompA-3180（P＜0.001）和△ompA-3488（P＜0.01）的生物膜形成能力较野生株显著增强，表明ompA-0703、ompA-3180 和 ompA-3488 基因参与负调控 E. miricola 生物膜的形成。 三，通过分析 E. miricola ompA 基因缺失株的抗血清杀伤能力、对细胞的黏附入侵能力及其对蛙的致病力，研究了 ompA 基因对 E. miricola 致病性的影响。抗血清杀伤实验表明，5 株缺失株的抗血清杀伤能力与野生株基本一致。对 bEnd.3 细胞的黏附入侵实验表明，缺失株△ompA-0703（P＜0.01）、△ompA-3180（P＜0.001）和△ompA-3488（P＜0.001）黏附 bEnd.3 细胞能力较野生株显著下降，但入侵能力与野生株基本一致。选用缺失株 △ompA-0703、△ompA-3180、△ompA-3488 和野生株人工感染黑斑蛙。感染 3 d 和 5 d 后，缺失株在血液中的载菌量与野生株基本一致，缺失株在脾脏中的载菌量显著下降（P＜0.05，P＜0.0001）；感染 5 d 后，缺失株 △ompA-3488 在脑组织中的载菌量显著下降（P＜0.01）。记录攻毒 14 d 后黑斑蛙的存活率，发现缺失株的致死率显著低于野生株（P＜0.05）。上述结果表明，ompA-0703、ompA-3180 和 ompA-3488 基因影响 E. miricola 的黏附能力以及对蛙的致病性，在其致病过程中发挥了重要作用。
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