摘要
目的： 通过研究逍遥丸对非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）肝郁脾虚证病证结合大鼠粪便内源性代谢产物的改变及脂肪酸β氧化的影响，探讨逍遥丸的治疗机制。 方法： 采用SPSS随机分组法，将24只SD雄性大鼠分成对照组、模型组和治疗组（n=8）。给予高脂饮食+四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）背部皮下注射+饥饱失常+夹尾联合刺激4周，建立NASH肝郁脾虚证大鼠模型。建模成功后，治疗组大鼠给予逍遥丸水溶液灌胃，其余大鼠给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续给药4周。造模及给药期间，连续观察并记录各组大鼠的一般行为特征。给药结束后取材，分别采用苏木精-伊红（HE）染液和油红O染液对大鼠肝组织切片进行染色，在光学显微镜下观察其病理学变化，并进行半定量统计分析；采用微板法检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、总胆固醇（total cholesterol, T-CHO ）、甘油三酯（ triglycerides, TG ）和低密度脂蛋白胆固醇（ low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）的水平；酶联免疫吸附（Elisa）法检测大鼠海马体去甲肾上腺素（noradrenaline, NE）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）的含量和血清白细胞介素（Interleukin, IL）-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的含量。采用高通量液相色谱-质谱联用（liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS）技术对各组大鼠粪便代谢物进行高通量检测，分析差异代谢物及其所涉及的代谢途径。蛋白质免疫印迹（Western Blot, WB）、免疫组化（IHC）、免疫荧光技术（IF）对大鼠肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体α（ peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα）、过氧化物酶体增殖子活化受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor gamma coactivator 1α, PGC1α）、肉毒碱棕榈酰基转移酶 1α（carnitine palmityltransferase 1α, CPT1α）和酰基辅酶A氧化酶1（acyl-coa oxidase 1, ACOX1）的蛋白表达进行定量和定位检测；实时荧光定量（RT-qPCR）检测肝组织中PPARαmRNA、PGC1αmRNA、CPT1αmRNA和ACOX1mRNA的相对表达量。 结果： 1. 各组大鼠一般情况及肝郁脾虚证候指标 实验期间，对照组大鼠情绪稳定、毛发有光泽、摄食量及二便均正常；模型组毛发晦暗、枯燥，早期易怒、晚期抑郁，不思饮食，倦怠懒动，大便稀溏等，表现出诸多类似中医肝郁脾虚证的证候特征。 相比于对照组，模型组大鼠的肝指数明显升高（P＜0.01），体重指数和海马体5-HT、NE含量降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，治疗组肝指数明显下降（P＜0.01），体重指数和海马体5-HT、NE含量均升高（P＜0.05，P＜0.01）。 2. 各组大鼠肝组织病理学检测结果 光学显微镜下观察HE染色及油红O染色的大鼠肝组织切片发现，对照组大鼠的肝细胞有序排列，细胞索呈放射状分布，肝窦形态正常，细胞核清晰可见；与对照组相比，模型组肝细胞肿胀，其细胞质内出现许多圆形或近似圆形的大空泡（HE染色）或红色脂滴（油红O染色）、边界光滑，挤压细胞核至边缘位置，并有大量炎细胞聚集；与模型组相比，治疗组肝细胞轻微水肿，脂肪空泡数量明显减少，极少量炎细胞浸润。非酒精性脂肪性肝病的NAS评分、油红O染色阳性面积半定量统计分析，进一步证实了组织学观察结果。 3. 各组大鼠血清学生化指标及炎症因子检测结果 相比于对照组，模型组大鼠血清中ALT、T-CHO、TG、LDL-C、IL-1β、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.01），IL-10含量显著下降（P＜0.01）。逍遥丸对模型组上述指标均有明显的调节作用（P＜0.05，P＜0.01）。 4. 各组大鼠粪便代谢组学检测结果 与对照组比较，模型组大鼠粪便内57种代谢产物发生了明显变化，其中乙酰左旋肉碱、组胺、丙酮酸、L-丝氨酸、胞嘧啶等25种差异代谢物在逍遥丸干预后明显改善（P＜0.05，P＜0.01），主要涉及5条代谢通路：组氨酸代谢、精氨酸合成、嘌呤代谢、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、苯丙氨酸代谢。 5. 各组大鼠肝组织脂肪酸β氧化通路上关键酶的表达情况 与对照组比较，模型组大鼠肝组织内PPARα、PGC1α、ACOX1、CPT1α四种关键酶的转录与表达均下降（ P＜0.01 ）。而这些指标在逍遥丸组均有所上调（ P＜0.05，P＜0.01）。大鼠肝组织免疫组化及免疫荧光结果也证实逍遥丸对模型组上述指标具有上调作用。 结论： 1.逍遥丸可以改善NASH肝郁脾虚证大鼠肝脏脂质蓄积、血脂异常、肝功能损伤，回调粪便内源性差异代谢产物； 2.逍遥丸的治疗机制可能与上调肝脏组织中PPARα、PGC1α、ACOX1和CPT1α的转录表达，促进肝脏脂肪酸β氧化代谢有关； 3.逍遥丸调整NASH肝郁脾虚证大鼠粪便内源性代谢产物的含量及种类可能是通过调控脂肪酸β氧化实现的。
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