摘要
烟草是现代生物学研究中常用的模式植物，也是我国的重要经济作物之一。烟草属于喜温植物，早春低温（倒春寒）所致的冷害常导致烟株生长受阻、花期提前、产量下降等性状。本课题组的合作研究中，获得了一种经基因编辑后的溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶基因（LPEAT）的烟草突变体（CN35）,该突变体在大田生长条件下，初步表现出对低温和氮营养具有一定的正向反应。然而，国内外关于LPEAT响应低温则鲜有报道。本文对突变体的生长是否响应低温胁迫和氮营养变化进行了相关的分子生理研究，所获得的主要结果如下: 1）生物信息学分析显示，NtLPEAT编码的蛋白含405个氨基酸残基，分子量45.6kDa,在其第192-305氨基酸范围内有一个磷脂酰基转移酶结构域，属于LPLAT超级家族;遗传系统发育分析发现该基因在进化中高度保守。此外，在NtLPEAT的N端有一个α螺旋保守区域，有助于其在膜上的自由扩散。 2）通过q-PCR分析，鉴定了 NtLPEAT基因在烟草植物中的时空表达模式，以及在不同温度和氮营养状况下的表达量变化。发现NtLPEAT主要在植物中上部叶片中表达;与苗期对比，其mRNA水平随着植株的生长发育上调，在八片叶时期表达量达到最高，较苗期提升约38％,开花后其表达量则降低;在15℃冷胁迫下，NtLPEAT表达量无明显变化，低氮处理时其表达量上调约18％。 3）水培生长条件下，在冷胁迫（15℃）及低氮处理时，相较于其背景植株（K326）,突变体的生物量高约23％,GS和NR的酶活性分别降低了 21％和32％,铵态氮和硝态氮的含量则分别升高34％和8％。 4）在土培生长、低温及不同氮水平处理下，与野生型相比，突变体的生长能够较好地适应环境温度的变化，且其花期明显延迟（约13天）。植物受冷害后，发现突变体的抗氧化系统酶（ SOD,CAT,POD）的活性升高（分别为26％,40％和10％）,可溶性蛋白与可溶性糖含量提升9％、20％,而丙二醛、相对电导率较则降低22％、26％。此均与突变体具有较好的耐冷能力相关。 5）对低温处理下脂质代谢物的分析，与野生型相比发现突变体在脂类分子组成上有明显改变;鉴定到6种PE含量下降（55-75％）,7种PC含量降低（12-65％）,5种DAG含量下降了（15-40％）。 综上，本文鉴定了 NtLPEAT响应烟草生长发育、温度和氮营养的表达模式，发现该基因主要在植物营养生长期的叶片中有较高的转录，对温度的响应不明显，低氮营养下其表达上调。通过对植物生长表型的分析和相关生理指标及酶活测定，表明NtLPEAT的突变可改善烟草在低温（如15℃）和低氮下的生长适应能力，且与增强植物/细胞抗氧化性能、改变脂类代谢及膜的通透性、提高氮素同化能力等相关。所获得的上述结果，为更深入地解析NtLPEAT的分子生物学功能以及在作物分子育种中的应用潜力，提供了有一定价值的学术理论参考。
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