摘要
随着我国现代马业的发展，对于优良马种繁育和品种改良的需求越来越迫切。冷冻精液人工授精技术是家畜育种的重要方式，能有效减少疾病的传播，长期保存优秀基因，消除地理障碍，对品种改良具有重要影响。然而马精液冷冻技术尚不成熟，精液保存效果并不理想。本研究针对这一问题，以纯血马为试验对象，采用不同冷冻保存程序和稀释液成分对马精液进行冷冻保存，检测冻融后精子活率（Total motility,TM）、活力（Progressive motility,PM）、运动参数、质膜完整性（Plasma membrane integrity,MI）、顶体完整性（Acrosome integrity,AI)、线粒体膜电位（ Mitochondrial membrane potential,MMP）、活性氧含量，旨在为马精液冷冻保存程序和稀释液配方的优化提供参考。取得结果如下: （1）比较了不同离心力（800g、600g、400g）离心10min对马精液的影响，结果发现:在精子留存量方面，800g组显著高于其他两组（P＜0.05）,400g组最低。800g组与600g组的TM、PM和大部分运动参数（STR、VCL、VSL、VAP、ALH）结果相似，只是800g组的LIN和WOB更高（P＜0.05）。而400g组的效果最差，其TM、PM和运动参数均明显低于800g组（P＜0.05）。因此，800g,10min是适合纯血马精液的离心条件。 （2）比较了两种平衡方式对马精液冷冻保存的影响。方式1:将精液4℃平衡3h后再进行细管分装;方式2:将精液细管分装后再4℃平衡3h。结果发现:两种方式的冻融后精子TM、PM、MI、AI和MMP均无显著差异（P＞0.05）。值得注意的是，方式1的精子MI有高于方式2的趋势（P=0.067）,表明平衡方式对精液保存效果有一定影响。 （3）比较了距液氮面不同高度（2cm、3cm、5cm）熏蒸和程序冷冻仪冷冻精液的效果（TM、PM、MI、AI、MMP）。结果发现:熏蒸高度为2cm和3cm时可以得到较好的冷冻效果，与程序冷冻仪效果相似。 （4）比较了不同浓度（0、1.0％、2.5％、5.0％）大豆卵磷脂（Soy lecithin,SL）与4％卵黄（Egg yolk,EY）对马精液冷冻保存的影响。结果发现:1％SL、2.5％SL和5％SL以及4％EY均可明显改善精子冻融后的TM、PM和MI（P＜0.05），其中1％SL、2.5％SL与4％EY效果相似，而5％SL组的PM明显低于这三组（ P＜0.05）,5％SL组的MI较2.5％SL组有下降的趋势（P=0.070）。5％SL和4％EY均能明显改善精子的 AI （P＜0.05），而 1％和 2.5％SL 组则明显低于 4％EY 组（P＜0.05）。1％SL、4％EY和无添加组的MMP结果相似，而2.5％和5％SL组则明显较低（P＜0.05）。因此,1％～2.5％的SL可提供与4％EY相似的保护效果，有助于马精液冷冻保存。 （5 ）比较了不同浓度（0、0.2、0.4、0.8mg/mL）的黄芪多糖（Astragalus polysaccharide,APS）和 0.77mg/mL 谷胱甘肽（Glutathione,GSH）及其组合对马精液冷冻保存的影响。结果发现:单独添加APS时，0.2或0.4mg/mLAPS可明显改善马精子的TM和MI （P＜0.05）,而高浓度（0.8mg/mL） APS则是有害的。APS需要达到0.8mg/mL才能显著提高MMP和降低活性氧含量（P＜0.05）,低浓度（ 0.2mg/mL、0.4mg/mL） APS存在这种趋势。单独添加0.77mg/mL GSH并没有明显效果。联合添加 APS 和 GSH 时，0.2 或 0.4mg/mL APS+0.77mg/mL GSH 可明显改善 TM 和 MI（P＜0.05）。0.4mg/mL APS+0.77mg/mL GSH有改善PM的趋势，且在MI方面显著优于单独添加（P＜0.05）。0.2mg/mL APS +0.77mg/mL GSH可显著提高MMP和减少活性氧（P＜0.05）,并且有优于单独添加的趋势。因此，单独添加APS的适宜浓度为0.2～0.4mg/mL,有利于马精液的冷冻保存。联合添加APS和GSH时，以0.2～0.4mg/mL APS与0.77mg/mLGSH为宜，且总体优于单独添加。 综上所述，本研究确定了适合纯血马精液的冷冻保存程序:将过滤后的精液用稀释液1∶1稀释后，以800g,10min进行离心，再加入冷冻保存稀释液重悬精子。将重悬后的精子保存在离心管中，离心管置于装有常温水的烧杯中，将烧杯置于4℃冰箱中平衡3h,使精子缓慢降温至4℃,之后在4℃冰柜中进行细管分装，距离液氮面2～3cm熏蒸15min或用程序化冷冻仪冷冻后投入液氮中进行保存。本研究还确定了在纯血马精液冷冻保存稀释液中，大豆卵磷脂适宜的添加浓度为1％～2.5％,与4％卵黄的保护效果相似;单独添加APS时的适宜浓度为0.20～0.40mg/mL;当APS和GSH联合添加时，适宜浓度为0.20～0.40mg/mLAPS+0.77mg/mLGSH。
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