摘要
藻胆体的重要组成部分为藻胆蛋白，而组成藻胆蛋白的脱辅基蛋白可以与不同的藻胆色素结合，因此形成的藻胆蛋白具有不同的光谱特性。近红外荧光探针在活体成像领域具有广泛的应用前景，具有穿透力强、对细胞毒性小、组织伤害小和较高的荧光亮度等优点。目前，已有的荧光探针并不能满足生物研究的所有需求，需要更多优质的荧光蛋白来应对日益增多的研究需求。藻胆蛋白的光谱特性使其更适合研究体内近红外荧光探针。为了进一步得到性质优良的荧光蛋白，我们利用别藻蓝蛋白基因作为模板，来进行随机突变实验，并将突变后的基因导入到含T7启动子诱导系统的质粒中。然后在模式生物大肠杆菌中，进行细胞的诱导与蛋白表达，从而筛选出荧光量子产率高、摩尔消光系数优良、有效荧光亮度得到显著提升的突变体。 为了得到性能更好的荧光蛋白，本实验是在 ΔBDFP1.9 的基础上，通过随机突变实验构建突变体库，再将筛选出来的突变体通过与BV色素重组后进行异源表达。首先是通过测突变体的细胞荧光光谱进行初步筛选，然后蛋白纯化提纯突变体的蛋白，根据突变体的蛋白吸收光谱与荧光光谱计算相关参数对突变体进行复筛；将筛选出的突变体，进行测序，确定具体突变位点，最后根据各突变体的优点综合筛选。 通过重组异源表达， 筛选出 11 个突变体，各突变体蛋白与 BV 色素结合后，其吸收峰在660 nm 左右，荧光峰在 670 nm 左右。大部分突变体的蛋白荧光较模板ΔBDFP1.9，都有一定程度的提升，其中Variant-9的蛋白荧光提升最显著，其荧光峰值提升了3.2倍。与模板ΔBDFP1.9相比，Variant-2、Variant-5的吸收与荧光都发生了一定程度的红移，其中 Variant-2 的吸收峰红移了 4 nm，Variant-5 的吸收峰红移了7 nm，分子亮度分别提升了 1.43 倍和 1.5 倍。所有突变体的分子亮度均得到了提升，其中Variant-8的提升的最显著，提高了2.49倍；Variant-1的分子亮度相对提升的较少，只相对模板提升了1.26倍。 转染动物细胞表达结果表明，各突变体与模板成功在动物细胞中表达。经过计算，Variant-1 的相对有效亮度提升了约 24％，Variant-2 的相对有效亮度提升了约30％，Variant-4的相对有效亮度提升了约17％，Variant-5的相对有效亮度提升了约35％，Variant-8的相对有效亮度提升了约8％。 最后，以不同梯度的pH、不同浓度盐酸胍以及恒定温度下的时间梯度来研究在细胞内有效荧光亮度得到提升的Variant-1、2、4、5、8的稳定性。Variant-1、2、4、5、8与模板对pH的耐受度基本趋于一致，都相对更适用于酸性标记环境；低浓度的盐酸胍对模板和突变体蛋白荧光影响相对较小，但是高浓度的盐酸胍会破坏蛋白荧光；模板与突变体蛋白可以适应短期高温环境，但是长时间高温环境会对突变体蛋白荧光信号产生影响。
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