摘要
银杏内酯是银杏提取物中主要的活性物质，目前已报道约12种，分别是常量银杏内酯GA、GB、GC、GJ、白果内酯BB，微量银杏内酯GK、GL、GN、GP、GQ、GM等。银杏内酯具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基等广泛的生理作用，对保护脑缺血损伤、增强心肌收缩力和保护神经损伤均有显著作用。银杏内酯B（GB）为研究最活跃的化合物之一，其还具有抗肿瘤作用，可抑制卵巢癌、乳腺癌等多种瘤细胞的生长和增殖，抗肿瘤靶点和通路较丰富。除GB外的其它内酯化合物的抗肿瘤研究尚未见报道。 为构建天然源银杏内酯化合物库并研究银杏内酯抗肿瘤活性，开发内酯单体制备液相色谱纯化工艺，实现常量银杏内酯快速制备，开发稀有内酯化合物GL、GK、GN合成工艺，解决从植物材料中分离纯化稀有内酯困难和成本高的问题。初步研究银杏内酯对SKOV3卵巢癌细胞的抑制活性，以GB为母核拼接具有抗肿瘤作用的苯甲酸类小分子侧链，合成了系列GB-苯甲酸衍生物，初步评价衍生物抗肿瘤活性。研究内容及结果如下： （1）以银杏总内酯为原料，优化获得最佳制备液相色谱分离条件为：流动相：甲醇∶水=30∶70，流速95 mL/min，柱温35℃，进样量10.0 mL/次，分离时间60 min；蒸发光检测器检测条件：雾化室温度70℃，载气为N2，流速2.5 L/min，单次最大上样300.0 mg。可一次制备得到的5种常量内酯单体，分别为GC、GJ、BB、GA、GB，纯度＞98.0%，收率＞95.0%，具有分离快速、高效的优势。 以GA、GB、GC分别为底物制备稀有内酯GK、GL、GN的简便方法。最佳合成工艺条件为：GA、GB、GC各100.0 mg分别溶于干燥的二氯甲烷，搅拌，氮气保护下降温至-25℃，滴加3.0 mL/gDAST反应0.5 h，室温搅拌至底物反应完全，纯水淬灭，旋蒸除去有机溶剂，乙酸乙酯萃取，浓缩，甲醇溶解，高压制备液相色谱纯化。分别制备得到稀有内酯GL 22.8 mg、纯度98.3%、收率22.8%，GK 44.0 mg、纯度99.0%、收率42.7%，GN 7.3 mg、纯度98.6%，收率9.0%。 （2）噻唑蓝（MTT）法体外细胞实验初步研究了已获得的8个天然内酯对SKOV3卵巢癌细胞的生长抑制作用，结果表明：100μmol/L GA、GB、GC、GJ、GK、GL、GN和BB对SKOV3细胞的抑制率分别为28.76%、37.5%、36.79%、22.8%、20.2%、26.74%、11.12%、14.79%。半数抑制率浓度IC50值分别为28.22μmol/L、14.93μmol/L、15.33μmol/L、34.21μmol/L、39.36μmol/L、＞100μmol/L、＞100μmol/L、23.39μmol/L，其中GB对卵巢癌细胞SKOV3的抑制活性最强。 （3）基于活性最优原则选择GB（1）为原料，分别用对氯苯甲酸、对氟苯甲酸、对甲氧基苯甲酸、3-甲氧基苯甲酸、对硝基苯甲酸、3''5''-二硝基苯甲酸进行酯化反应，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化剂和1-乙基-碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)缩合剂作用下合成。反应结束后，经高压制备色谱纯化得到合成衍生物2～12，并通过核磁共振谱进行了 1H NMR、13C NMR结构表征确定结构。其中GB C-1位衍生产物有：1-( 4-氯苯甲酰基) GB（2）、1-( 4-氟苯甲酰基) GB（4）、1-( 4-甲氧基苯甲酰基) GB（6）、1-( 4-硝基苯甲酰基) GB（8）、1-( 3-甲氧基苯甲酰基) GB（10）、1-(3''5''-二硝基苯甲酰基)GB （12）；GB C-10位衍生产物有：10-( 4-氯苯甲酰基)GB（3）、10-( 4-氟苯甲酰基) GB （5）、10-( 4-甲氧基苯甲酰基) GB（7）、10-( 4-硝基苯甲酰基) GB（9）、10-( 3-甲氧基苯甲酰基) GB（11）。SciFinder数据库检索证实这11个GB衍生物为未经文献报道过的新化合物。 (4) 体外细胞实验初步研究了GB及11种GB-苯甲酸衍生物对SKOV3卵巢癌细胞的生长抑制作用。噻唑蓝（MTT）法体外抑制肿瘤增殖活性测试显示化合物2、3、6、7、10、11对人卵巢癌细胞SKOV3有较好的抑制活性，其IC50值分别为16.05 μmol/L、13.72 μmol/L、63.30 μmol/L、31.79 μmol/L、46.93 μmol/L、24.65 μmol/L。Annexin V/PI双染法测试显示化合物3诱导SKOV3细胞凋亡稍优于1、6、10，凋亡率为37.10%。分析发现C-10位酯化衍生产物诱导SKOV3细胞凋亡活性高于C-1位的酯化衍生产物。
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