大黄酚对缝隙连接阻断剂Gap26预处理的星形胶质细胞线粒体转移的影响

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中文摘要：脑缺血是一种常见的脑血管疾病，在我国的发病率呈逐年上升趋势。Hayakawa K等研究发现，在体外缺血损伤的模型中，星形胶质细胞能够将功能性的线粒体转移到神经元，增强缺血损伤的神经元的活性。课题组前期通过采用 Mitotracker Red 荧光探针标记星形胶质细胞线粒体的方法，发现星形胶质细胞线粒体可以转移到神经元细胞，而大黄酚（chrysophanol, CHR）能够促进星形胶质细胞线粒体转移到神经元，提高神经元的活性。缝隙连接（gap junction, GJ）是介导细胞线粒体转移的途径，在线粒体转移中起到重要作用。有文献发现，缝隙连接阻断剂 Gap26 会加剧与星形胶质细胞共培养中的神经元损伤。所以GJ很可能是星形胶质细胞中线粒体转移的重要环节。在缺血缺氧损伤中，缝隙连接阻断剂Gap26 是否影响星形胶质细胞线粒体转移以及是否通过GJ加剧了神经元细胞死亡尚未可知。课题组前期研究显示，在神经元细胞和星形胶质细胞缺血缺氧损伤中CHR促进星形胶质细胞线粒体转移，改善神经元的缺血性损伤。但CHR的作用机制是否通过GJ来完成尚不明确。因此，本实验将Gap26预处理的星形胶质细胞与神经元共培养，进行氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）损伤，通过测定神经元存活率和Mitotracker Red 标记星形胶质细胞线粒体，共聚焦显微镜测定荧光标记物，追踪线粒体的转移。通过阻断剂Gap26 预处理星形胶质细胞探讨CHR对缺血损伤星形胶质细胞线粒体转移的作用机制。一. 建立星形胶质细胞和神经元共培养OGD/R模型从新生的 SD 乳鼠的大脑皮质中提取原代星形胶质细胞和神经元体外培养。利用Transwell小室建立共培养体系，进行OGD/R损伤。二. 星形胶质细胞经Gap26预处理与神经元共培养对OGD/R损伤中星形胶质细胞线粒体转移的影响采用 Gap26对星形胶质细胞进行预处理，然后将星形胶质细胞与神经元共培养进行OGD/R损伤。以CCK-8测定神经元存活率为指标，观察Gap26对神经元存活率的影响；采用Mitotracker Red 将星形胶质细胞提前进行标记，通过共聚焦显微镜测定神经元中荧光标记物。 1. 星形胶质细胞经Gap26 预处理后对神经元存活率的影响细胞实验分为4组：对照Ⅰ组（神经元常氧培养）；模型Ⅰ组（神经元 OGD/R 培养）；共培养Ⅰ组（星形胶质细胞与神经元共培养OGD/R）；Gap26 共培养Ⅰ组（Gap26 预处理的星形胶质细胞与神经元共培养OGD/R）。 CCK-8 结果显示，共培养Ⅰ组神经元的细胞存活率为（47.27± 8.20）%，而加入Gap26后神经元存活率降低（38.24±5.44）%（P＜0.01），结果表明，星形胶质细胞经 Gap26 预处理与神经元共培养进行OGD/R损伤降低神经元存活率。 2. 星形胶质细胞经Gap26预处理后对星形胶质细胞线粒体转移的影响实验分为2组：①共培养MR组②Gap26共培养MR组，Gap26预处理的星形胶质细胞，通过 Mitotracker Red 荧光探针提前标记星形胶质细胞中线粒体，与神经元共培养OGD/R，采用共聚焦显微镜测定神经元中荧光标记物，观察星形胶质细胞线粒体转移的数量。荧光结果显示，荧光标记物呈红色。①组镜下视野可见，红色呈不规则点状，排列松散；②组镜下视野可见，红色只有零星散布，与①组相比，荧光标记物数量减少。结果表明，Gap26 可减少星形胶质细胞线粒体转移到神经元。三. 大黄酚对Gap26 预处理的星形胶质细胞线粒体转移的影响经Gap26预处理的星形胶质细胞，加入CHR，与神经元共培养进行 OGD/R 损伤。然后测定神经元存活率、神经元内 ATP 含量以及检测神经元线粒体形态。实验分为 5 组：对照Ⅱ组（神经元常氧培养）；模型Ⅱ组（神经元OGD/R培养）；共培养Ⅱ组（星形胶质细胞与神经元共培养OGD/R）； CHR 共培养Ⅱ组（加入浓度为10 μmol·L-1CHR，星形胶质细胞与神经元共培养OGD/R）;Gap26+CHR共培养Ⅱ组（Gap26预处理后的星形胶质细胞，加入浓度为10 μmol·L-1CHR，与神经元共培养 OGD/R）。 1. 大黄酚改善共培养OGD/R神经元存活率 CCK-8 结果显示，共培养Ⅱ组中神经元的存活率为（ 49.41 ± 8.40）%，加入CHR神经元的存活率为（53.39±5.42）%（P＜0.01），表明CHR可以提高共培养OGD/R中神经元存活率；与CHR共培养Ⅱ组相比，加入Gap26后神经元存活率为（37.70±3.00）%（P＜0.001），结果表明，大黄酚可以提高星形胶质细胞与神经元共培养OGD/R后神经元的存活率，而Gap26可以对抗大黄酚的作用。 2. 大黄酚改善共培养 OGD/R神经元线粒体形态 ImageJ 软件分析显示，共培养Ⅱ组神经元线粒体长度为对照Ⅱ组的（51.45±3.70）%，加入CHR后神经元线粒体增长为（68.82±3.17）%（P＜0.01），表明CHR可以增加共培养OGD/R神经元线粒体长度；而加入 Gap26 后，Gap26+CHR 共培养Ⅱ组线粒体长度为（44.22± 6.33）%（P＜0.001），表明大黄酚可以增长 OGD/R 后神经元线粒体长度，使线粒体形态逐渐正常化，Gap26预处理会对抗大黄酚的作用。 3. 大黄酚改善共培养OGD/R神经元细胞内ATP 含量。 ATP结果显示，共培养Ⅱ组ATP含量为（43.98±1.66）%，加入CHR后，ATP含量为（58.17±7.48）%，ATP含量升高（P＜0.001），表明CHR增加共培养OGD/R神经元内ATP含量；加入Gap26后，ATP含量为（37.81±3.11）%，与CHR共培养Ⅱ组相比，ATP含量降低（P＜0.001），结果表明，大黄酚可以提高 OGD/R 损伤后神经元内 ATP含量，而加入Gap26会对抗大黄酚的作用。综上所述，缝隙连接阻断剂Gap26 可以阻断缺血性损伤中星形胶质细胞线粒体转移到神经元，GJ很可能是星形胶质细胞线粒体转移的重要环节。CHR促进星形胶质细胞线粒体转移的作用机制很可能与GJ有关。

作者：

耿宇涵

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关键词：

脑缺血大黄酚缝隙连接星形胶质细胞线粒体转移

授予学位：

硕士

学科专业：

药学;药理学

导师：

张丹参

学位年度：

2023

学位授予单位：

河北北方学院

语种：

中文

中图分类号：

R74