摘要
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）最早于20世纪70年代被发现，属于黄病毒科的一种单股正链RNA病毒，基因组全长约9.6kb。HCV与艾滋病病毒（HIV-1）具有同样的传播方式和易感人群，使得 HCV/HIV 合并感染广泛存在，尤其是在静脉吸毒人群（IDUs）中高度传播。HCV/HIV合并感染会加速HCV的传播和自然病程。云南位于我国的西南边陲，毗邻“金三角”鸦片产区，是通往我国其他地区的重要贩毒路线，而HCV和HIV传播与人口迁移和贩毒有关，因此云南成为HCV和HIV流行的关键地区。HCV基因组具有高度遗传多样性，目前已分为8个基因型和90种亚型，基因型分布呈地域差异性。为促使我国实现世卫组织提出的2030年消除丙肝这一战略目标，云南成为我国实现这一目标的重要一环。而目前仍缺少大样本系统性阐明云南HCV基因型亚型的流行特征和变化规律，以及仍需对云南真实世界HCV主要流行株3b和6型DAA治疗疗效及耐药相关突变进行研究。 共收集HCV单感染人群样本1464例，HCV/HIV合并感染人群样本282例，并下载已知地州和基因型的HCV/HIV合并感染人群样本1119例进行比较分析，发现云南HCV单感染以3b基因型为主，其后依次为1b、3a、6n、2a和6a亚型；HCV/HIV合并感染人群同样以3b亚型为主要流行基因型，其次是3a、6n、1b、6a、1a和6u；除2a仅在单感染中发现，6u仅在合并感染中发现外，其他基因型的流行率均无显著差异。比较云南16个地州HCV单感染与HCV/HIV合并感染之间的差异，发现保山1b亚型的HCV/HIV感染人群显著高于HCV单感染，红河和曲靖则表现出相反的结果，这两地HCV/HIV感染人群的3b显著高于HCV单感染。为回顾分析2008-2021年云南HCV基因型流行逐年变化特征，收集约50例/年慢性丙肝样本共成功分型788例，结果发现3b逐渐成为云南的主要流行基因型，其次是3a、1b和2a，在2019年后基因型流行率存在波动趋势，但3b依然为主要基因型，并且存在复杂的 GT6 型。对云南进行主要四种流行基因型进行进化分析、人口种群增长趋势和分子传播网络分析，所获结果均支持上述结论。 其次，本研究共成功获得3b全长199例，并对其E2区进行表征，发现3b共存在四个（Hyper variability region， HVR）高变区：HVR1，HVR3，HVR495和HVR575，使得3b亚型较其他亚型更难找到特异性免疫反应的靶标。截取全长的四段序列进行对比分析得出E1区最能真实反应全长的基因组特征。成功获得2009-2021年E1区序列约50/年共685条，进行分子进化和分子传播网络分析。结果显示，3b 在全球主要集中在东南亚和中国流行，推测 3b 可能起源于印度，并以云南为主要渠道传播到中国其他地区。系统发育进化树显示 3b 主要分为 7个谱系，云南 HCV 序列在全球分子传播网络中呈国内聚集状态，且占比最大，表明3b亚型在云南流行快、传播风险高。 对云南慢性丙肝人群进行基因分型时发现，两枝 HCV GT6 型序列与已知GT6型分开成簇，其bootstrap值分别为0.88和0.99，考虑此两枝可能为HCV GT6型新亚型。我们成功获得这两枝共10例HCV GT6型未知序列全长，并进行流行病学调查、全长系统发育进化树分析、重组分析及遗传距离分析。结果显示，这10例样本均没有流行病学联系；全长系统发育进化树显示，其中2例与未命名的KM35单独成簇，其余8例与未命名的KM41和KM45单独成簇；两簇均与其他已知GT6型未发生重组；计算遗传距离显示，两簇与其他GT6型的遗传距离均＞15%，两簇内序列间遗传距离均＜15%；因此将这两簇分别命名为6xi和6xj。根据BEAST进化起源时间推算，结果显示6xj约起源于1775年，是一种古老的毒株，6xi约起源于1971年。用所有已知和未知GT6型全长进行云南GT6型的遗传多样性分析，发现中国在全部已知GT6基因型中发现11种，占所有已知GT6基因型的33.33%，而云南首次报道GT6亚型频率占中国的63.64%，进一步证明了云南省GT6型的复杂多样性，并表明云南省是HCV GT6型发现的热点地区。 HCV变异所致的治疗失败是病毒性肝炎最大的临床问题，其中 3b 亚型的DAA 药物治疗最具挑战性。我们共收集随访的 73 例 HCV 单感染者、58 例HCV/HIV合并感染者，收集其基线、用药结束和停药12周的临床信息及血浆样本。通过对两个人群感染的风险因素进行调查发现，既往小诊所打针、输液、纹眉、纹身和静脉注射吸毒是两个人群感染的高风险因素。对两个人群三个时间点的生理生化指标进行统计分析发现，HCV单感染者在用药结束时和停药12周后与基线相比ALT、AST和GGT均存在显著差异（p＜0.001）；HCV/HIV合并感染者中，用药结束时和停药12周后与基线相比ALT、AST、Cr和RBC四个指标存在显著差异（p＜0.001）；且HCV/HIV合并感染人群的ALB值在随访过程中的三个时间点均显著高于HCV单感染人群。此外，两个人群的SVR率表现出相似的结果，分别为97.26%和100%。两个人群中多数患者同时存在NS5A区的A30K和L31M预存耐药突变，且HCV/HIV合并感染人群在这两个位点的预存耐药率均显著高于HCV单感染人群。通过对6例病毒学复发随访样本和68例仅治疗失败样本与大数据未使用DAA药物治疗人群相比，发现NS5A区的M53V和P97S可能是3b潜在新的耐药突变。另外，通过对HCV GT6型随访样本进行分析发现，GT6型整体治疗效果较好，但偶然也有治疗失败的发生，通过对1例6xj治疗前后样本进行NGS（Next genome sequencing，NSG）测序，发现NS5A-V28M和NS5B-A442V可能是6xj中潜在新的耐药突变。 综上所述，通过对云南HCV进行系统的分子流行病学分析发现，3b已成为云南HCV主要基因型，3a、1b和2a次之，GT6型极其复杂多样。HCV E1区基因序列进化分析发现， 3b可能起源于印度，主要分为7个谱系，其中6个谱系中呈国内聚集状态，云南省占比最大，推测为3b主要流行和高风险传播地区。此外，成功鉴定并命名了6xi和6xj两个GT6新亚型，6xj是一种古老的毒株。通过对云南 3b 和 GT6 型 DAA 临床疗效比较分析，发现云南 HCV 单感染和HCV/HIV 合并感染人群感染的风险因素及临床治疗效果没有显著差异，但都存在少数病例的复发，同时比较了HCV和HCV/HIV感染人群临床指标的差异，并发现4个潜在新的耐药突变。本论文对云南HCV的分子流行病学特征和DAA临床疗效进行了系统研究，为防控HCV的传播、优化丙型肝炎治疗方案提供了重要的科学依据。
NETL