摘要
由于人口老龄化问题加剧，神经退行性疾病的发病率和死亡率不断增加，目前仍然缺乏有效的治疗手段。神经退行性疾病的发病机制复杂，其中氧化应激会导致神经细胞功能紊乱，表现为记忆功能障碍，为其重要的发病机制。因此，寻找抗氧化物质保持体内氧化还原平衡，成为治疗氧化应激损伤引起的神经退行性疾病的新策略。三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen是常用的人参属中药材，具有抗氧化活性，在中风、老年痴呆、震颤麻痹等疾病的治疗方面发挥作用。传统上三七生熟异用，通过炮制后三七中主要皂苷成分转化为稀有皂苷成分，由于其成分差异显著，可能导致不同抗氧化活性。通过比较生、熟三七的抗氧化活性，挖掘其抗氧化的标志成分，从而阐明生、熟三七以抗氧化活性改善神经损伤的内在保护作用机理。因此，本论文联合多种体外抗氧化活性方法考察生、熟三七的抗氧化活性，以 H2O2诱导 PC12细胞氧化损伤为模型，研究生、熟三七抗氧化损伤的神经保护作用，基于代谢酶探讨皂苷成分介导氧化应激反应发挥神经保护的作用机理，以阐明生、熟三七对 H2O2诱导 PC12细胞氧化损伤的保护作用及其相关内在机制，为中药三七的合理应用和开发提供基础，为治疗氧化应激相关疾病的新药研制拓展科学新方向。主要研究内容和结果如下： 1. 生、熟三七中皂苷类成分变化及其自由基清除作用 采用HPLC法分析生、熟三七中13种皂苷成分，结果显示随着三七蒸制次数的增加，生三七中主要皂苷（R1、Rg1、Re、Rb1、Rd）含量降低，而熟三七中稀有皂苷（20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5）含量增加。利用自由基清除原理建立 4种体外抗氧化模型，发现熟三七的抗氧化活性优于生三七。采用Pearson法测定生、熟三七中皂苷含量与抗氧化活性相关性，结果表明 ABTS和 DPPH自由基清除率与生三七中皂苷含量呈负相关，与熟三七中皂苷含量呈正相关，说明熟三七的抗氧化活性与稀有皂苷含量相关。 2. 生、熟三七中皂苷类成分对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用 采用 H2O2处理 PC12细胞建立氧化损伤模型，通过测定细胞存活率和细胞中ROS水平评价生、熟三七及13种皂苷成分的神经保护作用。结果显示，蒸制3次的熟三七和人参皂苷 Rk3提高细胞存活率和降低 ROS水平最显著。采用荧光显微镜观察细胞内 ROS荧光强度，可以直观看出蒸制3次的熟三七和人参皂苷Rk3显著降低 H2O2损伤后细胞内 ROS的蓄积。进一步探讨生、熟三七总皂苷对细胞内氧化应激指标的影响，结果表明生、熟三七总皂苷可升高 T-SOD、CAT、GSH、T-AOC水平，降低LDH水平，其中熟三七抗氧化应激损伤作用优于生三七。采用Hoechst 33342/PI染色检测细胞凋亡情况，结果显示生、熟三七总皂苷处理后从细胞形态学上凋亡细胞明显减少，其中熟三七抑制细胞凋亡作用优于生三七。蛋白免疫印迹结果表明，生、熟三七总皂苷通过抑制细胞中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9 的释放，促使抗凋亡蛋白 Bcl-2 的产生，从而减轻神经细胞的凋亡。在抗氧化防御系统中，Nrf2 是最关键的转录因子。生、熟三七总皂苷通过激活 Keap1-Nrf2/HO-1途径，促进 Nrf2核易位，激活抗氧化应激通路，从而减轻 H2O2对 PC12细胞的氧化损伤。进一步研究表明，熟三七中活性成分Rk3也通过激活Nrf2、促进Nrf2核易位，抑制氧化应激，从而抑制神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用。 3. 基于代谢酶探讨生、熟三七中皂苷类成分介导氧化应激反应发挥神经保护作用的分子机制 药物代谢酶是药物产生作用的重要靶点。生、熟三七总皂苷及人参皂苷Rk3对 Ⅰ 相药物代谢酶（CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4）、Ⅱ 相药物代谢酶（SULT1A1、SULT1A3、UGT1A6）及外排转运蛋白（BCRP）具有不同程度的调控作用，这些代谢酶与氧化应激反应密切相关。进一步研究表明，生、熟三七总皂苷及人参皂苷Rk3对H2O2诱导的PC12细胞中 I 相代谢酶 （CYP1A1、CYP1A2）蛋白表达水平具有抑制作用，而对 Ⅰ 相代谢酶（CYP2E1、CYP3A4）、Ⅱ相代谢酶（UGT1A6、SULT1A3）及转运体BCRP 蛋白表达水平具有诱导作用。生、熟三七总皂苷及活性单体 Rk3 可能通过调节代谢酶的活性而影响药物在体内的代谢，从而增强抗氧化作用。 结论： 生、熟三七均具有抗氧化活性，熟三七优于生三七。生熟三七活性差异主要原因可能是通过不同程度调节代谢酶，激活 Nrf2抑制氧化应激反应，抑制神经细胞的凋亡，而具有神经保护作用。
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