摘要
微孢子虫(microsporidia)是一类营寄生生活、由孢子形成的单细胞真核生物，能够感染多种脊椎动物和无脊椎动物，对宿主造成不同程度的病理损伤；其孢壁蛋白参与入侵和致病过程。近年来，在中华绒螯蟹(俗称河蟹，Eriocheir sinensis)中新发现一种微孢子虫被命名为中华绒螯蟹微孢子虫Hepatospora eriocheir，它可能是中华绒螯蟹肝胰腺坏死病(hepatopancreatic necrosis disease (HPND)的病原菌。中华绒螯蟹微孢子虫的侵染会造成肝胰腺变白、水化，严重时导致中华绒螯蟹死亡，对我国河蟹养殖业造成了极大的威胁。研究微孢子虫感染机制有利于寻找科学的防治措施，本研究首先采用多种方法观察微孢子虫导致的组织病理学特征；而后通过蛋白质组学、代谢组学分析感染微孢子虫前后河蟹的差异蛋白和代谢物，以初步分析微孢子虫的感染机制；然后克隆了一种孢壁蛋白HeSWP26，并进行蛋白的重组表达、纯化和多克隆抗体制备，利用间接免疫荧光对中华绒螯蟹微孢子虫HeSWP26进行定位分析。本论文研究包括三个方面： 1．中华绒螯蟹肝胰腺坏死病的病理学分析 首先对河蟹进行PCR检测，筛选出微孢子虫阳性样本和阴性样本。将不同样本的中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、心脏、肌肉、前肠、胃制备石蜡切片，利用Masson染色观察组织病理学变化，利用Calcoflour white染色检测组织内微孢子虫等真菌性病原的存在。Masson染色结果表明微孢子虫感染后细胞体积变大、边界模糊、细胞核边缘化；肝胰腺是H. eriocheir主要侵染的器官，肌肉中H. eriocheir载量相对较低，但病变程度高，这可能是因为机体需要通过分解肌肉中的营养物质获得能量。相比于Masson染色效果，Calcofluor white荧光染色效果更好，通过样品中发出蓝白色荧光颗粒便可以轻松判断H. eriocheir的位置和载量。肝胰腺超微结构显示H. eriocheir聚集成簇，能清晰看到高密度电子层构成的外孢子壁和透明状的内孢子壁。以上结果表明，肝胰腺中H. eriocheir载量最高，说明肝胰腺是H. eriocheir的主要侵袭部位，进而引起肝胰腺坏死病，这可能是因为肝胰腺代谢旺盛且储存大量的营养物质，H. eriocheir为自身生长、繁殖而做出的策略。 2．中华绒螯蟹肝胰腺应对微孢子虫感染的差异蛋白组与代谢组学分析 对微孢子虫阳性样本和阴性样本的肝胰腺进行蛋白质组学和代谢组学分析，共定量得到370个差异蛋白和113种明显差异的代谢物，其中多种免疫相关蛋白差异表达，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-硫-转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、C型凝集素、巨噬细胞迁移抑制因子等。另外，糖酵解(磷酸甘油酸变位酶、果糖二磷酸醛缩酶)、TCA循环(异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶)、脂肪酸β-氧化(酰基肉碱)、溶血磷脂（LysoPE、LysoPI、LysoPC）等与能量代谢相关的蛋白和代谢物发生明显变化。KEGG通路表明这些差异蛋白和代谢物参与细胞代谢(如谷胱甘肽代谢、鞘磷脂代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、甘油磷脂代谢)与生物合成(泛酸和辅酶A生物合成、玉米素生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、激素合成)。以上结果表明H. eriocheir感染显著影响河蟹的能量代谢及多种相关酶活性，说明中华绒螯蟹在H. eriocheir入侵时积极地作出免疫应答反应，同时H. eriocheir侵染时会大量竞争宿主能量以供自身的发育、繁殖，最终引起中华绒螯蟹肝胰腺病变、死亡。 3．中华绒螯蟹微孢子虫HeSWP26的特性分析 在H. eriocheir的基因组发现一个孢壁蛋白HeSWP26，该基因ORF为681 bp，编码 227 个氨基酸，预测等电点为 5.21 ，蛋白分子量为 26 kDa。构建pET28a-HeSWP26重组质粒进行重组蛋白原核表达、蛋白纯化和抗体制备；经Western blot检测制备的抗体特异性良好。利用制备的抗体对病蟹多组织进行免疫组化分析，结果表明H. eriocheir在肝胰腺、心脏中的载量较高，是H. eriocheir的主要寄生场所。最后通过间接免疫荧光实验对HeSWP26在H. eriocheir中的定位进行了分析，结果表明HeSWP26定位于H. eriocheir的孢子壁，暗示HeSWP26可能参与H. eriocheir的侵染过程。
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