摘要
目的： 胶质瘤（glioma）是最常见的中枢神经系统肿瘤，其高侵袭、无限增殖的恶性生物学行为易致肿瘤复发、预后差。因此，探寻胶质瘤高侵袭相关的靶基因对于治疗和预后评估具有重要的临床意义。课题组前期研究证实ASAP3在胶质母细胞瘤中高表达并作为主要研究对象，拟通过生物信息学分析其在胶质瘤中的表达及调控下游关键靶基因和信号通路，并在胶质瘤组织中进行验证，进而通过体外细胞实验及体内动物实验，验证ASAP3通过YBX1调控NOTCH3信号通路促进胶质瘤恶性生物学行为的分子机制，为寻找临床治疗胶质瘤潜在的靶基因提供新方向。 方法： （1）初步分析胶质瘤相关公共数据库中ASAP3的表达与胶质瘤患者的临床参数、分型及预后的相关性；采用GSEA方法对胶质瘤临床数据进行分析，探讨ASAP3在胶质瘤发生发展过程中可能参与的信号通路。选择201例成人胶质瘤石蜡包埋组织样本制作组织芯片，采用免疫组织化学方法在胶质瘤石蜡组织芯片中检测ASAP3和相关蛋白NOTCH3的表达并分析其与患者临床病理参数、预后的相关性，同时，分析二者与异柠檬酸脱氢酶1（Isocitratedehydrogenase1，IDH1）是否突变、1p19q共缺失和CDKN2A缺失之间的关系。（2）在细胞水平建立ASAP3过表达和敲低稳转株，采用CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Transwell检测细胞侵袭和迁移，分析ASAP3对胶质瘤细胞增殖、周期、凋亡、侵袭、迁移以及TMZ敏感性的影响。在动物水平使用ASAP3过表达和敲低稳转株建立小鼠皮下及颅内原位移植瘤模型，监测小鼠移植瘤的体积和重量，采用苏木精-伊红染色、免疫组织化学法以及活体热成像仪观察ASAP3对小鼠体内移植瘤的影响。（3）在细胞水平，采用免疫沉淀联合液相质谱技术筛选胶质瘤细胞中ASAP3相互作用的蛋白分子，利用生物信息学分析其下游关键蛋白YBX1及NOTCH3信号通路的关系，免疫荧光、Co-IP和GSTpull-down实验进一步验证ASAP3与YBX1的互作关系。通过对ASAP3下游靶基因YBX1进行siRNA小干扰质粒转染实验，分析ASAP3与YBX1对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移及NOTCH3信号通路的影响。探讨ASAP3促进胶质瘤恶性生物学行为的作用及可能影响的信号通路。 结果： （1）在胶质瘤公共数据库CGGA、TCGA_GBMLGG、Rembrandt和Grevendeel中综合分析结果提示，高表达ASAP3与胶质瘤患者的临床进展、分级和不良预后有关；GSEA分析显示ASAP3与NOTCH3信号通路密切相关。在胶质瘤组织样本中，ASAP3高表达与WHO分级（PA=0.021，PO=0.016）和Ki-67（PA=0.005，PO=0.045）的表达相关，NOTCH3高表达与WHO分级（PA=0.006，PO=0.016）及Ki-67（PA=0.012，PO=0.006，PGBM=0.032）的表达相关，ASAP3和NOTCH3表达存在相关性（r=0.311，P＜0.001），二者亦是胶质瘤预后差的独立影响因素（P＜0.001）。ASAP3与NOTCH3表达与IDH1突变有关，与1p19q共缺失无关，NOTCH3与CDKN2A缺失有关。（2）ASAP3过表达促进了U251细胞增殖、侵袭、迁移、抑制了TMZ药物的敏感性，促进了小鼠移植瘤的增殖和侵袭（P＜0.05）；ASAP3敲低抑制了U87MG细胞增殖、侵袭和迁移，促进了细胞凋亡、使细胞阻滞于G2/M期，增加了TMZ药物的敏感性，抑制了小鼠移植瘤的增殖和侵袭（P＜0.05）。（3）在U251细胞中过表达ASAP3，筛选出与ASAP3相关的71个蛋白并进行生物信息学分析，结果发现ASAP3与YBX1及NOTCH3信号通路有关。Co-IP和GSTpull-down实验结果显示ASAP3和YBX1存在共定位和直接作用关系。在ASAP3过表达的U251胶质瘤细胞中，进行质粒siRNA干扰YBX1的表达，实验结果发现下调YBX1可一定程度抑制ASAP3促进胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的能力，并降低NOTCH3、HEY、HES1因子的表达（P＜0.05）。 结论： ASAP3在胶质瘤组织中高表达并与不良预后相关，其促进了胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移。ASAP3通过YBX1调控NOTCH3信号通路促进了胶质瘤恶性生物学行为，该结果为胶质瘤发生发展的分子调控机制提供实验依据和新的研究方向，ASAP3有望成为临床治疗胶质瘤的潜在新靶点。
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