摘要
糖尿病是一种由糖脂代谢紊乱引起的慢性代谢性疾病。目前以胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）为主要特征的 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者约占90％。由高脂饮食诱导的慢性低度炎症是影响IR发生与发展的重要因素。Toll样受体4（Toll-like receptor4, TLR4）介导的炎症信号通路是产生促炎反应的重要通路之一。游离脂肪酸（free fat acid, FFA）是其重要配体之一，当机体肥胖时，脂肪细胞分泌的FFA会激活TLR4促炎通路分泌炎性细胞因子，通过直接或间接的方式抑制胰岛素信号传导，最终导致IR。 正常情况下，机体的免疫系统通过促炎和抗炎系统的相互作用，维持机体免疫功能的动态平衡。主要由迷走神经、脾脏与脾交感神经、乙酰胆碱和α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR ）构成的胆碱能抗炎通路（ cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP），具有快速、可逆和准确的特点，是机体抗炎的基本途径。该途径的激活可改善肥胖诱导的炎症和IR。 为观察在高脂饮食诱导的IR中，TLR4与α7nAChR的作用，9～10 周龄野生型小鼠和 TLR4 基因缺失（TLR4-/-）小鼠分别随机分为 2组：WT基础饮食组小鼠，WT高脂饮食组小鼠，TLR4-/-基础饮食组小鼠和 TLR4-/-高脂饮食组小鼠。常规饲养，每周称量体重，8 周后，对小鼠实施葡萄糖耐量实验（glucose tolerance test, GTT），间隔一周后，进行胰岛素耐量实验（insulin tolerance test, ITT）；麻醉处死小鼠后称量小鼠体脂肪质量；酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的炎症指标水平；Western Blotting技术检测胰岛素作用的关键靶组织——肝脏中胰岛素信号通路的关键蛋白——蛋白激酶B（protein kinase B, PKB或Akt）和胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate 1, IRS-1），及其磷酸化蛋白激酶B （phosphorylated protein kinase B, p-Akt）、磷酸化胰岛素受体底物-1 （phosphorylated insulin receptor substrate 1, p-IRS-1）的表达水平；检测肝脏和脾脏中α7nAChR表达水平，分析肥胖导致的IR条件下TLR4对肝脏和脾脏中α7nAChR表达的影响。 高脂饮食诱导构建IR模型后，对小鼠体重变化进行评估，结果显示，与基础饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组WT小鼠的体重明显增加（P＜0.0001），基础饮食组 TLR4-/-小鼠体重明显下降（P＜0.01），高脂饮食组TLR4-/-小鼠体重明显增加（P＜0.05）；与高脂饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组TLR4-/-小鼠体重明显降低（P＜0.0001）。对小鼠全身脂肪质量进行评估，结果显示，与高脂饮食组 WT 小鼠相比，基础饮食组 WT 小鼠、基础饮食组 TLR4-/-小鼠全身脂肪质量均明显降低（P＜0.001），高脂饮食组TLR4-/-小鼠全身脂肪质量明显降低（P＜0.01），提示高脂饮食会导致小鼠体重和脂肪质量增加；而TLR4基因缺失能够明显改善小鼠体重及脂肪质量的增加。与基础饮食组 WT 小鼠相比，高脂饮食组WT小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性明显降低（P＜0.001），提示高脂饮食会导致胰岛素抵抗的发生；与高脂饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组 TLR4-/-小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性明显升高（P＜0.05和P＜0.01），提示TLR4基因缺失能够明显改善小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。 TLR4 对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠血清炎性因子水平影响的实验结果显示，与基础饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组WT小鼠TNF-α和IL-6水平明显升高（P＜0.05)，基础饮食组TLR4-/-小鼠TNF-α和IL-6水平明显降低（P＜0.05)；与高脂饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组TLR4-/-小鼠TNF-α和IL-6水平明显降低（P＜0.01和P＜0.05)，提示高脂饮食会导致炎症水平升高；也提示了TLR4基因缺失能够明显改善高脂饮食诱导的炎症水平。 高脂饮食和TLR4信号对胰岛素信号通路影响的实验结果显示，与基础饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组WT小鼠的p-Akt蛋白表达降低（P＜0.05），总Akt蛋白表达无差异（P＞0.05），p-Akt/Akt比值降低（P＜0.05）；与基础饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组WT小鼠的p-IRS-1蛋白表达升高（P＜0.05），总IRS-1蛋白表达下降（P＜0.05）p-IRS-1/ IRS-1比值升高（P＜0.05）；基础饮食组WT，高脂饮食组和低脂饮食组TLR4-/-组小鼠肝脏组织中的p-Akt、Akt、p-IRS-1和IRS-1的表达水平均无统计学意义（P＞0.05）。以上结果提示，TLR4 基因的缺失会降低高脂饮食对肝脏组织胰岛素信号通路的关键信号分子Akt和IRS-1蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响。 为探讨TLR4促炎通路与CAP在调控高脂饮食诱导的胰岛素抵抗中的联系，我们检测了CAP的重要器官脾脏和胰岛素作用的重要靶组织肝脏中 TLR4 蛋白和 α7nAChR 的表达。结果显示，与基础饮食组WT小鼠相比，高脂饮食组WT小鼠肝脏和脾脏的TLR4蛋白表达水平均提高（P＜0.05），高脂饮食组WT小鼠肝脏和脾脏的α7nAChR蛋白表达水平均下降（P＜0.05），基础饮食组和高脂饮食组 TLR4-/-小鼠的α7nAChR 蛋白表达水平均下降（P＜0.001）；基础饮食组和高脂饮食组TLR4-/-小鼠的α7nAChR蛋白表达水平无差异。即TLR4炎症通路的过度激活会降低肝脏和脾脏的α7nAChR表达，TLR4基因的缺失也会降低肝脏和脾脏的α7nAChR表达。 综上，高脂饮食通过改变肝脏组织中胰岛素信号通路关键信号分子Akt和IRS-1的磷酸化水平，导致IR；高脂饮食导致肝脏组织和脾脏组织CAP关键作用蛋白α7nAChR的表达下降，提示高脂饮食损伤了外周组织的CAP；TLR4基因缺失保护了小鼠免受高脂饮食诱导的IR；TLR4过度活化和TLR4缺失均会导致肝脏和脾脏α7nAChR表达降低，说明TLR4信号和胆碱能抗炎通路存在相互作用，TLR4可能通过调节脾脏和肝脏α7nAChR受体的表达和/或与它们的相互作用参与了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。
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