摘要
第一部分中老年2型糖尿病合并肌少症炎症指标的变化及临床意义 目的：2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）增加肌少症的患病风险。慢性炎症参与两者的发病过程，本部分研究拟探讨NLRP3相关炎症指标及炎性复合指标在中老年T2DM合并肌少症患者中的变化及临床意义。 方法：收集2019年10月-2022年9月在秦皇岛市第一医院内分泌科住院的T2DM患者，完成双能X线测定体成分，四肢骨骼肌质量指数（appendicularskeletalmusclemassindex,ASMI）定义为四肢骨骼肌质量（kg）除以身高（m）的平方，握力测定，6米步速的评估及基本身体检测指标的评估，留取血清标本，测量生化指标，测量NLRP3、IL-1β、IL-8炎症指标，计算中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyteratio,NLR)、血小板与淋巴细胞比值(platelet-to-lymphocyteratio,PLR)、系统免疫炎症指数(systemicimmuneinflammationindex,SII)、预后营养指数(prognosticnutritionalindex,PNI)炎症复合物指标。入组共448人。将纳入患者按是否存在肌少症分成肌少症组（152人）和非肌少症组（296人）。 结果： 1.与非肌少症组相比，肌少症组患者的平均年龄高[68.8（8.79）vs64.4（8.41），Plt;0.05]，糖尿病病程长[11.7（9.59）vs9.6（8.10），Plt;0.05]，心血管疾病患病比例高（28.9%vs19.6%,Plt;0.05），BMI水平[24.26（2.86）vs25.99（3.24）kg/m2]、维生素D水平[42.07（11.22）vs46.40（13.97）nmol/L]及血浆白蛋白水平[41.54（4.8）vs43.79（13.97）g/L]低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 2.与非肌少症组相比，肌少症组的炎症指标NLRP3[5.92（0.82）vs5.52（0.74）]、IL-1β[2.57（0.54）vs2.18（0.42）]、IL-8[4.77（0.96）vs4.50（0.78）]及中性粒细胞计数[3.97（1.43）vs3.68（1.33）]升高，差异有统计学差异(Plt;0.05)。在系统性炎症评估指标中PNI降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 3.ASMI与其余变量相关性分析，ASMI与年龄(r=-0.112）、HbA1c（r=-0.097）、糖尿病病程（r=-0.105）、NLRP3（r=-0.120）、IL-1β（r=-0.148）呈负相关，差异有统计学意义(Plt;0.05)。与全身肌肉质量（r=0.808）、BMI（r=0.403）、维生素D（r=0.276）、血浆白蛋白（r=0.105）及PNI（r=0.102）呈正相关，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 4.机体炎症指标中NLRP3、IL-1β与ASMI、握力及步速均为负相关，差异有统计学意义(Plt;0.05)，IL-8与步速呈负相关，差异有统计学意义(Plt;0.05)。PNI与ASMI、握力及步速均呈正相关，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 5.多元线性回归分析显示以ASMI为因变量，年龄、HbA1c、糖尿病病程、NLRP3、IL-1β、维生素D、血浆白蛋白、BMI及PNI为自变量，维生素D水平（β=0.237，Plt;0.05）与BMI（β=0.378，Plt;0.05）正向预测ASMI值，HbA1c（β=-0.097，Plt;0.05）、IL-1β（β=-0.184，Plt;0.05）负向预测ASMI。 6.多因素二元Logistic回归分析以是否发生肌少症为因变量，NLRP3、IL-1β、IL-8、PNI、性别、年龄、BMI、糖尿病病程、HbA1c、冠心病病史、血浆白蛋白、维生素D水平为自变量，男性肌少症患病风险增高85%（OR=1.847，95%CI1.016~3.085），高于中位数水平的NLRP3（P50th以上）（OR=2.047，95%CI1.234~3.396）、高于中位数水平的IL-1β（P50th以上）（OR=2.087，95%CI1.254~3.473）及患有心血管疾病的人群（OR=2.257，95%CI1.284~3.967）发生肌少症风险均明显增加(Plt;0.05)。血浆白蛋白(OR=0.943，95%CI0.898~0.991)、维生素D(OR=0.968，95%CI0.948~0.989)及BMI（OR=0.802，95%CI0.735~0.875）均能减少肌少症的患病风险(Plt;0.05)。 结论： 1.与T2DM非肌少症患者相比，T2DM合并肌少症组的患者平均年龄高，糖尿病病史时间长，心血管疾病的患病比例高，BMI水平、维生素D水平及血浆白蛋白水平均低。 2.与T2DM非肌少症患者相比，T2DM合并肌少症组的炎症指标NLRP3、IL-1β、IL-8及中性粒细胞计数升高，PNI水平低。 3.进行多因素回归分析中，男性、高于中位数水平的NLRP3、高于中位数水平的IL-1β及心血管疾病均是T2DM患者发生肌少症的独立危险因素。血浆白蛋白水平、维生素D水平及BMI水平越高，T2DM发生肌少症的风险相对越低。 第二部分自噬-NLRP3在高糖诱导C2C12小鼠肌细胞衰老发生中的作用 目的：通过不同葡萄糖浓度干预小鼠C2C12肌细胞，探讨高糖是否可以通过自噬-NLRP3炎性小体影响C2C12肌细胞衰老，对T2DM肌少症发病机制进行一定探索。 方法： 1.不同葡萄糖浓度（5.5mM，25mM，40mM）及siRNA-NLRP3转染细胞后培养C2C12小鼠肌细胞。采用WB及免疫荧光检测NLRP3炎性小体相关蛋白及MURF1和Myogenin的表达水平，Elisa检测细胞培养液中IL-1β水平。 2.观察自噬对C2C12肌细胞炎症激活及衰老的作用，分为不同干预组[Control组（5.5mM/L葡萄糖）；HighGlucose（40mM/L葡萄糖）；Control+3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）（5mM）；HighGlucose（40mM/L葡萄糖）+雷帕霉素（Rapamycin,RA）（200nM）]，将mcherry-EGFP-LC3双标腺病毒进行转染，采用激光共聚焦检测自噬流，电镜技术检测自噬体，采用WB及免疫荧光检测自噬相关蛋白、NLRP3炎性小体相关蛋白及MURF1和Myogenin的表达水平，Elisa检测细胞培养液中IL-1β水平。 结果： 1.与Control组相比，HighGlucose-25mM组和HighGlucose-40mM组Caspase-1、NLRP3、MURF1蛋白表达升高，ASC免疫荧光强度增强，细胞培养基中的IL-1β活性升高，Myogenin蛋白表达下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与HighGlucose-40mM+NC组相比，HighGlucose-40mM+SiNLRP3组Caspase-1、NLRP3、MURF1蛋白表达水平降低，ASC免疫荧光强度减弱，培养基中的IL-1β活性减低，Myogenin表达升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 2.自噬双标腺病毒的检测结果显示，与Control组相比，HighGlucose组和Control+3-MA组自噬小体和自噬溶酶体的数量减少，与HighGlucose组相比，HighGlucose+RA组自噬小体和自噬溶酶体的数量增加，差异有统计学意义(Plt;0.05)。WB结果显示，与Control组相比，HighGlucose组和Control+3-MA组p62蛋白表达增加，LC3II/I比值下降，p62免疫荧光水平增加，与HighGlucose组相比，HighGlucose+RA组p62蛋白表达下降，LC3II/I比值升高，p62免疫荧光水平下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 3.与Control组相比，HighGlucose组和Control+3-MA组细胞培养基中的IL-1β活性升高，细胞中Caspase-1、NLRP3、MURF1蛋白水平升高，Myogenin蛋白水平下降，ASC免疫荧光强度增强，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与HighGlucose组相比，HighGlucose+RA组培养基中的IL-1β活性下降，Caspase-1、NLRP3及MURF1蛋白水平下降，Myogenin蛋白水平升高，ASC免疫荧光强度减弱，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 结论：高糖呈剂量依赖诱导C2C12小鼠肌细胞NLRP3炎性小体的激活，IL-1β水平升高，促发炎症反应，导致泛素化相关MURF1蛋白表达升高，促进细胞衰老的发生。上述过程与高糖作用下C2C12肌细胞自噬流下降有关，适当增强自噬可以减轻肌细胞的炎症反应水平，缓解细胞衰老的发生。 第三部分竖脊肌参数对2型糖尿病合并社区获得性肺炎预后影响 目的：T2DM患者感染风险高，易发生重症肺炎，骨骼肌质量与功能的评估对于判断机体的营养状态、生存预后有重要的意义。T2DM患者骨骼肌质量下降明显，进一步增加感染死亡风险。本部分研究采用常规胸部CT扫描胸12椎体层面的竖脊肌相关肌肉参数作为一种简便快捷的方法评估人体肌肉含量，探讨其对T2DM合并社区获得性肺炎（community-acquiredpneumonia,CAP）患者住院预后及远期生存的影响，评估其检验效能，拟对预后不良的患者做到早期风险识别及干预。 方法：回顾选取2015年1月至2018年12月在秦皇岛市第一医院因社区获得性肺炎住院的T2DM患者696例，其中男性400名，女性296名，平均年龄71.6±11.7岁。收集性别、年龄、住院天数、住院费用基本信息，提取患者糖尿病分型、病史及伴发慢性肾脏病、心力衰竭等疾病情况，收集患者发生感染性休克、是否应用呼吸机及出院是否发生死亡情况，收集患者肺部影像资料。胸12椎体（twelfththoracic,T12）层面双侧竖脊肌（dorsalskeletalmuscleareaatT12vertebrallevel,T12MA）定义为T12脊柱和肋骨后方区域内的任何肌肉，不超过竖脊肌的最外侧边缘。肌肉指数（skeletalmuscleindex,SMI）定义为T12MA与身高（m）平方的比值。根据出院患者是否死亡分为存活组（655例）和死亡组（41例）。 结果： 1.与存活组相比，死亡组患者平均年龄高[78.0(11.7)vs71.2(11.6)]，合并心力衰竭（53.7%vs23.5%）、慢性肾脏病（22.0%vs10.7%）比例高，应用有创通气（19.5%vs3.2%）、发生感染性休克（19.5%vs2.9%）及入住ICU（39.0%vs12.7%）的比例高，差异有统计学意义(Plt;0.05)。与存活组相比，死亡组患者白细胞计数高[14.8（13.1）vs9.8（5.9）]，CURB65评分高(2vs1)，血浆白蛋白[30.7（5.1）vs35.6（11.3）g/L]及BMI[22.0（3.9）vs24.9（4.5）kg/m2]水平低，T12MA[27.9（8.75）vs33.8（12.9）cm2]及SMI[9.99（2.95）vs12.4（3.4）cm2/m2]值低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 2.双变量相关分析显示SMI与年龄（r=-0.359，Plt;0.05）、CURB65（r=-0.295，Plt;0.05）、WBC（r=-0.095，Plt;0.05）呈负相关，与血浆白蛋白（r=0.122，Plt;0.05）和BMI（r=0.483，Plt;0.05）呈正相关。 3.多因素Logistic回归分析显示以住院患者死亡为因变量，以性别、年龄、吸烟史、BMI、T12MA、SMI、慢性肾脏病、心力衰竭、WBC、CURB65及血浆白蛋白为自变量，SMI(OR=0.876，95%CI:0.768~0.998，Plt;0.05)及血浆白蛋白水平（OR=0.894，95%CI:0.883~0.959，Plt;0.05）是T2DM合并CAP患者住院死亡的独立保护因素。CURB65（OR=1.630，95%CI:1.077~2.466，Plt;0.05）、心力衰竭（OR=6.250，95%CI:2.721~14.360，Plt;0.05）是其独立危险因素。应用倾向评分匹配(PSM)降低混杂偏移，PSM采用最邻近匹配法将死亡组与存活组按1:3匹配。匹配后结果显示，SMI是T2DM合并CAP患者住院死亡的独立保护因素(OR=0.849,95%CI:0.738~0.976,Plt;0.05)，心力衰竭(OR=2.772,95%CI:1.262~6.093,Plt;0.05)及WBC(OR=1.109,95%CI:1.034~1.190,Plt;0.05)是危险因素。 4.COX回归分析T2DM合并CAP患者远期预后显示，以随访截点发生死亡为因变量，以T12MA、SMI、年龄、性别、吸烟史、BMI、血浆白蛋白水平、CURB65评分、慢性肾脏病、心力衰竭、冠状动脉粥样硬化性心脏病及脑血管疾病、感染性休克及ICU为自变量，SMI是T2DM患者合并CAP患者远期死亡预后的保护因素(HR=0.929，95%CI:0.884~0.976，Plt;0.05)。心力衰竭(HR=1.600,95%CI:1.129~2.268，Plt;0.05)、冠状动脉粥样硬化性心脏病(HR=1.488，95%CI:1.059~2.090，Plt;0.05)和CURB65(HR=1.585,95%CI:1.346~1.866，Plt;0.05)是T2DM合并CAP远期死亡的独立危险因素。PSM匹配后进行COX回归分析显示，SMI是T2DM患者合并CAP患者远期死亡的独立保护因素(HR=0.880,95%CI:0.816~0.949,Plt;0.05)，心力衰竭(HR=2.420,95%CI:1.593~3.677,Plt;0.05)及CURB65评分(HR=1.327,95%CI:1.051~1.675,Plt;0.05)是独立危险因素。 结论：T2DM合并CAP患者住院死亡组中，年龄越大，死亡风险越高，其中合并心力衰竭、慢性肾脏病、发生有创通气、感染性休克及ICU住院的比例高。SMI水平是T2DM合并CAP患者住院死亡的独立保护因素。心力衰竭是T2DM合并CAP住院患者死亡的独立危险因素。SMI可以影响T2DM合并CAP患者住院死亡及远期死亡。
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