摘要
目的：肝癌是世界范围内影响人类健康的公共卫生问题。虽然肝癌的治疗方式在过去几十年里有了长足的发展，但是肝癌的治疗仍然面临着复发、转移和耐药等诸多问题。要解决这些问题，我们必须要了解肝癌细胞生物学行为的调控机制。课题组前期采用基因芯片分析发现基因FAM111B，具有序列相似度为111B的基因家族（FamilyWithSequenceSimilarity111，FAM111B）在肝癌组织中高表达，可能是肝癌相关的一个癌基因，其功能机制不清楚；而既往在其他肿瘤研究发现FAM111B可作为蛋白水解酶发挥蛋白水解功能和参与细胞中DNA修复、细胞周期和凋亡调节的基础功能。据此，我们提出FAM111B在肝癌发展中发挥重要作用的假设。本研究旨在探讨FAM111B对肝癌细胞生物学行为的影响以及对其潜在作用机制进行挖掘。 方法： 1、利用癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）数据库中相关数据，分析对比了正常肝组织与肝癌组织及肝癌组织与相对应癌旁组织中FAM111B的转录差异，并结合临床数据来分析FAM111B的表达水平与肝癌患者TNM，原发灶、淋巴结转移、远处转移（TumorNodeMetastasis，TNM）分期及生存期的关系。 2、首先，通过qRT-PCR对24例配对的肝癌组织与癌旁组织中FAM111B的mRNA差异进行验证。接着，使用IHC检测15对人肝癌组织与相对应癌旁组织FAM111B的蛋白表达。 3、利用qRT-PCR和westernblot分别检测人肝细胞系L02和人肝癌细胞系PLC/PRF/5、HepG2、Hep3B、MHCC97L、SK-Hep1、Huh7、MHCC97H、Bel-7402、Bel-7405和HCCLM3中FAM111B的mRNA转录情况和蛋白表达情况。 4、选择FAM111BmRNA水平较高的SK-Hep1构建敲低稳转株，利用慢病毒包装含有短发夹核糖核苷酸（shorthairpinribonucleicacid，shRNA）的质粒，再感染SK-Hep1细胞系，经过抗性筛选后得到稳定表达相应shRNA的敲低稳转株。然后通过qRT-PCR以及westernblot方法分别从mRNA水平和蛋白水平来说明FAM111B的沉默成功。接着，进行FAM111B敲低稳转株的细胞功能实验，包括增殖实验（CCK-8、平板克隆实验）、迁移实验（划痕实验、Transwell）。 5、选择FAM111B的mRNA水平较低的MHCC97L构建过表达稳转株，将FAM111B的编码区序列（Codingsequence，CDS）克隆到相应的质粒，并进行慢病毒包装，再感染MHCC97L细胞系，经过抗性筛选后得到过表达稳转株。然后通过qRT-PCR以及westernblot分别从mRNA水平和蛋白水平来验证FAM111B过表达成功。接着，进行FAM111B过表达稳转株的细胞功能实验，包括增殖实验（CCK-8）、迁移实验（划痕实验、Transwell）。 6、将FAM111B过表达稳转株接种到BALB/c-nu裸鼠皮下进行皮下成瘤实验，观察FAM111B对肝癌细胞在体内成瘤能力的影响。 7、上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）促进肿瘤细胞的迁移，认为是导致肿瘤转移的重要机制，将从蛋白水平探讨FAM111B与EMT通路的关系，同时在裸鼠肺转移模型中探讨FAM111B对肝癌细胞肺定植的影响。 结果： 1、从生物信息学的角度，FAM111B在肝癌组织中的表达水平高于正常肝组织以及在肝癌组织中的表达水平高于相应癌旁组织，并且FAM111B高表达与预后不良相关。 2、利用qRT-PCR和IHC对人肝癌组织与相对应癌旁组织中FAM111B的mRNA转录水平和蛋白表达水平进行检测，发现肝癌组织的mRNA转录水平和FAM111B的蛋白水平相对升高。 3、相对人肝细胞系L02，人肝癌细胞系中FAM111B的mRNA转录水平及蛋白表达水平升高。 4、敲低FAM111B减弱了肝癌细胞的增殖及迁移能力。 5、过表达FAM111B增强了肝癌细胞的增殖及迁移能力。 6、过表达FAM111B增强了人肝癌细胞系MHCC97L在BALB/c-nu裸鼠体内的成瘤能力。 7、FAM111B的表达促进了肝癌细胞EMT的发生和肺定植。 结论： 1、FAM111B在肝癌组织中相对高表达且与肝癌患者临床预后不良相关。 2、FAM111B促进了肝癌细胞增殖和迁移的生物学行为，且通过EMT通路来促进肝癌细胞的肺定植。
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