摘要
秦岭石蝴蝶为中国秦岭地区特有的珍稀濒危保护植物，长久以来一直处于濒临灭绝的状态，且关于该物种的相关研究鲜有报道。本研究在人工繁殖秦岭石蝴蝶过程中首次发现了丰富的花器变异现象，通过统计花器变异类型和频率，发现了花器变异的规律。同时，进一步通过比较转录组学的技术从转录水平研究了花器变异的机制。此外，利用SCoT分子标记技术对秦岭石蝴蝶的2处野生种群和人工繁殖种群进行了遗传多样性分析。这些研究将为阐明秦岭石蝴蝶花器官变异的规律和机制以及秦岭石蝴蝶的濒危机制研究提供有价值的信息。主要结果如下： (1)通过观察2583朵秦岭石蝴蝶花朵，发现了23种花冠变异类型、5种萼片变异类型和7种可育雄蕊变异类型，总变异率分别为34.030%、38.482%和32.288%。秦岭石蝴蝶花梗或可分支，花梗苞片数目2~3枚。相关性分析结果表明，下唇数目与可育雄蕊数目呈正相关，相关系数为0.9274，而上唇数目与可育雄蕊数目呈负相关，相关系数为-0.4811，结合花型图示分析表明这可能与秦岭石蝴蝶雄蕊着生于花冠下唇内侧近基部有关。在花期对秦岭石蝴蝶野生种群的调查中未发现有类似人工种群花器官变异的现象。将野生植株移栽至人工栽培环境后，经过连续的观察，发现在第2次花期时有个别植株中出现了变异花朵。 (2)为研究秦岭石蝴蝶花器官变异及发育过程转录本表达情况，采用IlluminaHiSeq2500高通量测序平台技术对秦岭石蝴蝶两种主要花型的两个不同时期进行转录组测序。原始数据经过滤、拼接后共获得共获得Unigene序列113889个，其总长度为99295924bp，平均长度871.87bp，N50和GC含量分别为1592bp和38.57%。经功能注释后，共有超过11300多个Unigene成功获得功能注释。在组间差异表达基因的两两比较中，NAvsNB与VAvsVB表达差异基因分别为10665和10608，明显高于NAvsVA与NBvsVB的2917与3500，表明不同发育时期的秦岭石蝴蝶花朵差异基因数量明显高于正常类型与变异类型之间的差异基因数量。对表达差异基因进行筛选后初步挑选出27个可能与秦岭石蝴蝶花器官发育及变异相关的基因，进一步对4个比较组进行交叉比对分析，确定了6个可能与秦岭石蝴蝶花器官发育相关的基因，分别为PqMIF2、PqMYB340、PqMYB305、PqGATA12、PqCCD4和PqZBED。 (3)利用筛选到的24条SCoT引物，分析了秦岭石蝴蝶人工繁育和野生种群的遗传多样性和遗传结构。结果显示，60份秦岭石蝴蝶供试样品的观察等位基因数平均为1.51，有效等位基因数平均为1.31，Nei''s基因多样性平均为0.2305，Shannon指数平均为0.3703，这表明供试材料种群的遗传多样性较低。种群间的遗传距离与遗传相似系数分析结果表明，3个种群60份供试材料间的遗传相似系数为0.9551~0.9705，平均相似系数0.9634，这也进一步表明供试材料之间的遗传相似性极高，遗传背景较为狭窄。秦岭石蝴蝶种群分子方差分析结果显示15%的变异来自于种群间，而85%的变异来自于种群内部。综合分析表明秦岭石蝴蝶各种群内和种群之间的遗传多样性较低，遗传背景狭窄，这可能是秦岭石蝴蝶适应环境能力差，从而导致其濒危的重要原因之一。 以上结果表明，秦岭石蝴蝶人工种群花器官变异现象与遗传变异无关，是由环境和营养成分改变所导致的群体发育异常现象，但该现象在人工环境不变的情况下可持续发生。转录组分析结果表明，极有可能是由于环境改变引起部分基因差异表达最终导致花器官发育异常。遗传多样性分析结果显示无论是野生种群还是人工种群其遗传多样性均较低，且种群间遗传相似性极高。这可能是其野生种群一直处于濒危状态的主要原因之一。本研究对被子植物花器官发育模式和秦岭石蝴蝶的系统进化、生殖生态、种群保护与恢复以及今后观赏价值的开发应用方面研究具有一定的现实意义。
NETL