摘要
在哺乳动物基因组中，5mC是一种重要的DNA修饰，在基因调控、细胞分化、胚胎发生、X染色体随机失活、基因印记等表观遗传调控中发挥着重要作用。随着第三代测序技术的完善，ONT单分子纳米孔测序可以直接对DNA进行序列检测，并从单分子水平鉴定甲基化修饰状态，相比于常规的甲基化检测手段，具有长读长,能够对序列进行直接检测等的优势。猪作为一种理想的生物医学模型，对其全基因组范围内甲基化的鉴定有助于进一步理解表观遗传修饰的重要意义。因此，本研究首次利用ONT测序构建10个猪种(主要涉及我国华北型、江海型、西南型等地方猪、中国以及欧洲野猪)的全基因组5mC修饰图谱，探究复杂性状的遗传学基础和表观调控的重要网络。 研究1:10个猪种全基因组5mC修饰图谱构建。本研究使用Nanopolish软件对每个样本的全基因组CpG位点的甲基化修饰水平进行鉴定。通过整合所有样本，一共得到27,857,021个CpG位点，其中保守的CpG位点有19,836,456个(71.5％)。CpG位点在全基因组上的分布是不均匀的，多分布在染色体末端和局部区域，如CpG岛等。所有样本的平均甲基化水平为66.36-77.14％,同时基于甲基化水平对样本的聚类再现了组织的划分。CpG位点在全基因组的动态变化表现为:基因体的甲基化水平高于邻近的区间，在TSS周围观察到明显的低甲基化;CpG岛甲基化水平较低，而邻近区域甲基化水平逐渐升高。从总体上看，所有样本CpG位点甲基化水平的一致性较高。基于以上结果，本研究成功绘制了10个猪种单碱基分辨率的CpG5mC修饰图谱。 研究2:高原适应相关差异甲基化基因挖掘。本研究基于藏猪独特的生活环境和生理结构，对藏猪和中国地方平原猪进行了甲基化差异分析。一共鉴定到了76,400个极显著的差异甲基化位点(P＜0.001)。通过合并DML,得到252个差异甲基化区域，这些区域共覆盖了163个基因。通过对基因进行功能富集分析，发现许多GO条目与能量代谢有关，如ATP结合、GTP激活酶活性和蛋白激酶活性等。此外,一些已知的低氧适应相关通路被显著富集，包括血管平滑肌收缩和蛋白质消化吸收。在此基础上，筛选了三个相关候选基因:CALM1、PRKCQ和R4MP1。总的来说，本研究揭示了藏猪与其他中国地方猪种在低氧适应方面的DNA甲基化差异。 研究3:整合基因组、DNA甲基化和转录组，探究等位基因特异甲基化的作用和功能。本研究基于基因组和DNA甲基化数据，鉴定了每个样本的ASM,平均每个样本检出179.8kASM位点，占CpG位点的0.55％-0.82％,同时这些ASM显著富集在印记基因、CpG岛、启动子以及外显子区域，其中ASM在启动子区域的显著富集，暗示其可能在基因表达调控中发挥重要作用。此外，本研究发现ASM显著富集在promoter-like的染色质状态下，这些结果表明ASM与基因表达或基因转录调控显著相关，为ASM与基因调控区域共定位提供了理论依据。随后，本研究利用猪血液RNA样本，鉴定了ASE基因，ASM和ASE联合分析揭示了DNA甲基化的遗传调控与转录调控之间的关系。最后，本研究基于ASM,鉴定到了部分已知的印记基因，为ASM的应用提供了新思路。 综上所述，本研究首次利用ONT测序数据构建了猪种的5mC图谱，在单分辨率水平上阐明了不同品种的甲基化变异，并鉴定了低氧适应相关差异甲基化基因。进一步结合转录组数据，证明ASM对基因表达的重要调控作用。
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