摘要
黄曲霉毒素是一类主要曲霉属真菌产生的有毒次级代谢产物，在饲料原料中污染严重。摄入黄曲霉毒素污染的饲料会对畜禽产生慢性或急性毒性。目前饲料黄曲霉毒素生物脱毒是重要的研究课题。本课题组前期报道的地衣芽孢杆菌ANSB821-CotA漆酶是目前已知对黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1,AFB1）降解机理最清晰的一种细菌漆酶，且产物毒性降低，具有开发成饲料酶制剂的应用前景。本研究旨在通过分子改造技术提高CotA漆酶对AFB1的降解活性，并应用优化后的信号肽提高其在毕赤酵母中的表达效率。 试验一:首先通过前期文献调研确定了地衣芽孢杆菌ANSB821-CotA漆酶的突变位点E186A、E186R、E186K、F205Y、R208G、K315N、G322S、A376I、L385W、I417G、P454S、D500G,用一步PCR的方法成功构建了这12个CotA漆酶突变体。然后，将这12个突变体通过大肠杆菌表达系统进行外源表达，经镍亲和层析柱柱纯化得到纯酶。1μg/mLAFB1分别与20μg/mL纯酶在37℃条件水浴下反应12h,通过测定各突变体纯酶对AFB1的降解效率，筛选到2株对AFB1降解活性最高的突变体E186A和E186R,降解率分别为82.2％和91.8％,是野生型CotA漆酶（WT）对AFB1的降解效率的1.6倍和1.8倍。以ABTS为底物研究WT和突变体E186A和E186R的酶学特性，结果表明WT、E186A、E186R在pH2.0～8.0范围内均有活性，最适pH分别为4.0、4.0、3.0,在碱性条件下较稳定;随温度的升高酶的活性提高,且在50℃条件下水浴30min以内可以保持其初始酶活的50％以上;在90℃条件下，水浴60min之后，酶全部失去活力。研究WT和突变体E186A和E186R降解AFB1的酶学特性发现，WT催化降解AFB1的最适pH值为8.0,突变体E186A、E186R催化降解AFB1的最适pH值为9.0。无论是在酸性、中性还是碱性条件下，E186A、E186R对AFB1的降解效果都优于WT。WT与E186R降解AFB1的最适温度为70℃，E186A降解AFB1的最适温度为80℃。突变体E186R对AFB1的降解活性在不同温度下较WT均有改善。通过分子对接研究突变体E186A、E186R及WT与AFB1的结合模式发现，CotA漆酶的单点突变影响了酶（受体）和AFB1（配体）的对接方式。E186R上的Asp144与AFB1同时形成两条阴离子π键和一条氢键可能是其催化效率提高的原因。 试验二:为了提高CotA漆酶在毕赤酵母中的表达效率，将试验一中对AFB1降解效率提高的突变体E186A、E186R以及野生型WT转入信号肽优化的表达载体pPICZαA-N,并用电转化的方式成功转入毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPICZαA-N-WT、GS115-pPICZαA-N-E186A、GS115-pPICZαA-N-E186R。带有野生型CotA漆酶序列的未进行信号肽优化的载体转入GS115作为对照，构建工程菌GS115-pPICZαA-WT。用甲醇诱导4株工程菌发酵产酶，结果表明，在4株工程菌的发酵上清中均检测到漆酶活性，其中GS115-pPICZαA-N-E186R发酵上清对AFB1降解效率最高，是野生型GS115-pPICZαA-N-WT的1.6倍。GS115-pPICZαA-N-WT发酵上清对AFB1的降解效果较GS115-pPICZαA-WT提高,证明优化后的信号肽可以改善目的蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，进一步表明突变体E186R比野生型CotA漆酶的催化活性提高。 综上所述，地衣芽孢杆菌ANSB821-CotA漆酶突变体E186R对AFB1的催化效率提高，运用信号肽优化的载体在可以实现CotA漆酶在毕赤酵母中的高效表达，有望开发成黄曲霉毒素降解酶制剂，进行工业化生产和产业化应用。
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