摘要
实验目的：血管内皮细胞作为血管最内层的细胞，可以将血液循环和其他组织分隔开来，起到物理屏障的作用，也能够合成并释放许多血管活性物质以维持正常血管系统的动态平衡。内皮素1（Endothelin1，ET-1）存在于血管内皮细胞（VascularEndothelialCells，VECs）和广泛组织细胞中，是由21个氨基酸组成的血管活性肽，是迄今已知最强的缩血管物质。内皮细胞受到刺激合成并释放ET-1，其调控主要在基因转录水平。End1基因转录活性或模式的改变导致的ET-1水平升高，与许多心血管疾病的病理过程中密切相关。近端ET-1启动子对多种刺激有反应，包括血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）、缺氧、转化生长因子（TransformingGrowthFactor，TGF）、凝血酶和肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactorα，TNFα），而AngⅡ通过引起内皮细胞凋亡和功能障碍在心血管疾病中发挥核心作用。已经在许多心血管疾病中观察到，由于ET-1转录过度激活，导致内皮素的水平升高。我们之前已经证明在VECs中，血清反应因子（SerumResponseFactor，SRF）是调控ET-1转录的重要因子之一。SRF磷酸化是迄今最广为熟知的一种翻译后修饰方式，一系列的磷酸激酶包括糖原合酶激酶3（GlycogenSynthaseKinase3，GSK3）都以SRF为底物，GSK3作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，GSK3对SRF的磷酸化能促进SRF与心肌素相关转录因子（MRTF-A）相互作用，促进海马神经元的轴突生长。但GSK3对SRF的磷酸化在ET-1的表达中的作用尚不清楚。所以我们研究了GSK3对SRF的磷酸化在AngⅡ诱导的ET-1的表达中发挥的作用。 实验方法：使用AngⅡ诱导人脐静脉细胞融合细胞（EAhy926）中ET-1的转录，沉默或药物抑制GSK3β，通过qRT-PCR、ELISA、免疫印迹实验和免疫共沉淀进行ET-1、GSK3β和SRF基因表达水平的检测。通过一系列的荧光素酶报告基因、ChIP实验和Re-ChIP实验，来评估GSK3β介导的SRF磷酸化是ET-1启动子上转录复合物组装所必需的。 实验结果：我们发现在血管内皮细胞中AngⅡ诱导ET-1转录伴随着GSK3β的激活。接着，研究发现AngⅡ诱导ET-1的表达依赖于GSK3β。此外，发现GSK3β对ET-1启动子的影响序列靠近SRF位点，将该位点突变之后，发现ET-1启动子对过表达组成活性的GSK3β的响应完全消除，暗示了SRF参与GSK3β激活ET-1的表达。接着研究发现GSK3β与SRF相互作用并磷酸化SRF。而MRTF-A是SRF的一个关键共激活因子，进一步发现磷酸化SRF与MRTF-A的相互作用，通过招募组蛋白修饰相关的表观遗传因子，比如招募染色体重构蛋白（BRG1）使染色体结构松散，招募H3K4的甲基转移酶SET1和H3K9的组蛋白去甲基转移酶JMJD1A，增加H3K4的三甲基化和减少H3K9的二甲基化，促进内皮细胞ET-1的转录。 结论：我们的结果表明，GSK3β通过磷酸化SRF增强SRF与MRTF-A的相互作用，进而招募BRG1、SET-1和JMJD1A到ET-1启动子区，增加组蛋白H3K4三甲基化和减少H3K9的二甲基化，最终促进ET-1转录，所以可以针对GSK3β-SRF轴设计干预靶点和诊疗策略。
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