摘要
背景： 神经母细胞瘤是幼儿最常见的颅外实体瘤，属于胚胎型肿瘤，起源于交感神经系统发育中的细胞。神经母细胞瘤患者根据首诊年龄、肿瘤组织病理学、细胞分化、DNA指数(倍体)、染色体11q缺失和MYCN基因扩增状态被分为低、中、高风险组。高危神经母细胞瘤占所有病例的近50%，主要包括18个月以上患有转移性疾病(M期)的儿童或患有MYCN扩增的肿瘤儿童。低风险神经母细胞瘤肿瘤可以在不治疗的情况下自发消退，但高危神经母细胞瘤发展和转移，并对治疗产生抗药性。神经母细胞瘤的治疗通常是根据患者病情，采取个性化的治疗方案。神经母细胞瘤肿瘤表现出高度的遗传变异性，给新药物开发带来困难。因此，针对神经母细胞瘤的治疗仍然任重而道远。 转录超级增强子通过诱导癌基因（如MYCN）的转录和过度表达在肿瘤的发生发展中发挥关键作用，转录超级增强子活性受BET溴结构域蛋白BRD4(超级增强子“读取器”)和组蛋白乙酰转移酶CBP和p300(超级增强子“编写者”)控制。超级增强子和相关的转录因子网络塑造了神经母细胞瘤细胞的表观遗传学和转录图谱，并确定了细胞的特性。BET和CBP/p300双重抑制剂NEO2734阻断BRD4和CBP/p300结合至超级增强子，从而抑制超级增强子的活性和癌基因转录，在骨髓瘤、淋巴瘤和白血病展示出有良好的抗癌作用，但在体内单药治疗往往不能发挥更好地抗肿瘤作用。 目的： 研究NEO2734对MYCN基因扩增的神经母细胞瘤的抗癌效果，筛选发现与NEO2734起最显著协同抗癌作用的药物来提高对神经母细胞瘤的疗效，并确定其潜在的作用机制。 方法： 1.阿尔玛蓝细胞活力检测实验。通过使用来自美国国家癌症研究所的临床批准的抗肿瘤药物集(AODs)，按照单独使用DMSO（二甲基亚砜），NEO2734，166种AODs（1μM），或者分别联合使用166种AODs（1μM）和NEO2734（500nM）处理MYCN扩增型的SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞，72h后使用阿尔玛蓝细胞活力检测进行对比观察分析完成初次筛选。 2.用初次筛选得出Ceritinib（色瑞替尼）等22种药物，按照单独使用DMSO（二甲基亚砜），5个不同浓度的NEO2734，5个不同浓度Ceritinib等22种药物，或者联合使用5个不同浓度的NEO2734和5个不同浓度Ceritinib等22种药物组处理同样具有MYCN扩增型的SK-N-BE(2)和CHP134神经母细胞瘤细胞，72h后使用阿尔玛蓝细胞活力检测进行对比观察分析完成二次筛选。 3.单独使用DMSO(二甲基亚砜)，酪氨酸激酶抑制剂Ceritinib、NEO2734、或者联合使用Ceritinib和NEO2734处理非恶性的MRC-5胎儿肺成纤维细胞，72h后使用阿尔玛蓝细胞活力检测进行对比观察分析完成协同细胞毒性验证。 4.通过流式细胞分析实验，在SK-N-BE(2)细胞中按照单独使用DMSO（二甲基亚砜），NEO2734（1000nM）、Ceritinib（960nM）、或者联合使用NEO2734（1000nM）和Ceritinib（960nM）处理神经母细胞瘤细胞，72h后使用凋亡试剂染色进行对比观察分析细胞死亡的类型。在CHP134细胞中按照单独使用DMSO（二甲基亚砜），NEO2734（500nM）、Ceritinib（2000nM）、或者联合使用NEO2734（500nM）和Ceritinib（2000nM）处理神经母细胞瘤细胞，72h后使用凋亡试剂染色进行对比观察分析细胞死亡的类型。 5.按照同方法4一样的分组和药物浓度处理MYCN扩增型的SK-N-BE(2)和CHP134神经母细胞瘤细胞，免疫印迹实验需药物处理24h和48h，实时荧光定量RT-PCR需药物处理12h和24h后，对比检测神经母细胞瘤细胞中N-Myc蛋白及mRNA表达水平。 6.在SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞中敲低CBP、P300、或者CBP/P300，然后蛋白质免疫印迹和实时荧光定量RT-PCR检测敲低效率，通过克隆形成实验检测对细胞增殖能力的影响，并进一步通过BALB/C裸鼠的肿瘤细胞异种移植瘤实验在体内证实CBP和P300对肿瘤进展的影响。（本实验正在进行中）。 结果： 1.经过初筛选出了Ceritinib（色瑞替尼）等22种可能与NEO2734起协同拮抗MYCN扩增型的神经母细胞瘤细胞的药物以及在1μM浓度下对细胞毒性太大而无法评估协同抗癌作用的药物。 2.经过二次筛选选出了Ceritinib（色瑞替尼）等3种与NEO2734起协同拮抗MYCN扩增型的神经母细胞瘤细胞的药物，其中Ceritinib(色瑞替尼)与NEO2734的协同抗癌作用最好。 3.使用Certinib单独和联合NEO2734处理MRC-5非恶性胎儿肺成纤维细胞，两种药物单独或者联合对MRC-5细胞没有协同杀伤作用。 4.流式细胞分析实验结果揭示，NEO2734和Ceritinib协同导致MYCN癌基因扩增型的SK-N-BE(2)和CHP134神经母细胞瘤细胞凋亡。 5.在MYCN癌基因扩增型的SK-N-BE(2)和CHP134神经母细胞瘤细胞中，单独使用NEO2734处理降低了N-MycmRNA和蛋白表达（p值＜0.001），单独使用Ceritinib显示没有效果，联合使用Ceritinib和NEO2734处理不能协同下调N-Myc蛋白及mRNA表达水平（p值＞0.05）。 结论： NEO2734降低MYCN癌基因扩增的神经母细胞瘤细胞增殖。抗癌药物筛选确定Ceritinib是与NEO2734在MYCN癌基因扩增的神经母细胞瘤细胞中发挥最有效协同抗癌作用的抗癌药物。NEO2734和Ceritinib联合治疗协同导致MYCN癌基因扩增型的神经母细胞瘤细胞凋亡,但对正常非恶性细胞没有毒性。NEO2734降低N-Myc蛋白和mRNA表达水平,但NEO2734和Ceritinib联合治疗并不能协同降低N-Myc蛋白和mRNA表达水平。 NEO2734与Certinib协同抗癌的作用机制需进一步探究，同时在体内进行实验验证，以便进行潜在的临床试验。
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