摘要
茅苍术为菊科苍术属多年生草本植物，江苏茅山地区道地中药材，喜阴凉干燥气候，目前主产区位于湖北、内蒙古等地，其道地产区一般公认的是江苏茅山地区。中医常以其干燥的根茎入药，具有养肝明目、祛风散寒的功效，其活性成分主要为倍半萜类化合物，主要贮存在根茎中。近年来，茅苍术野生资源匮乏，人工栽培也有一定的难度，主要表现在人工栽培种活性成分含量低和质量不稳定，对茅苍术种质资源的优化非常必要。在前期研究中，课题组通过高温胁迫和激素处理得到一株茎提前发育的突变型茅苍术组培苗，较野生型茅苍术组培苗长势更好，倍半萜含量更高。为了探究突变型茅苍术高效合成倍半萜的原因，本研究从植物表观性状和生理生化的角度出发，对野生型茅苍术和突变型茅苍术进行了比较分析，同时结合转录组和蛋白质组两种组学技术系统阐释突变株的优势原因所在，最后从倍半萜合成关键基因分子表征的角度，在生化合成途径上进一步验证了突变株高效合成倍半萜的生化机制。 首先，我们对野生型和突变型茅苍术的农艺学指标、倍半萜含量和生理生化指标进行了测定。结果发现，突变型茅苍术较野生型茅苍术具有生长快，挥发油含量高的特点，不同时期的突变型茅苍术的ATP含量均高于野生型茅苍术1-3倍，主要依赖于突变型茅苍术三羧酸循环的高效性。与茅苍术生长发育、倍半萜合成相关的赤霉素、茉莉酸等植物激素的含量在突变型茅苍术中常常高于野生型。茎提前发育突变型茅苍术多个代谢通路活性的提高导致了其快速生长发育、高效合成倍半萜的优势。 其次，我们对野生型茅苍术和突变型茅苍术进行了总RNA和全蛋白提取，并进行转录组和蛋白质组分析。转录组分析发现倍半萜和三萜生物合成途径，以及植物激素信号转导途径的相关基因的表达量在突变型茅苍术的变化显著。蛋白质组分析发现，差异表达蛋白出现在能量代谢类别的频次最高，其次为信号转导，说明突变型茅苍术较野生型茅苍术能量代谢更加活跃。其中NAD(P)H氧化还原酶上调了5倍，为变化倍数最大的差异蛋白。其次为信号转导，一些信号转导途径相关蛋白出现了上调或下调，其中NAC转录因子上调了7倍，MYB转录因子下调了2倍。这些改变都促使茅苍术更积极地通过初级代谢合成次级代谢需要的前体物质和能量，为高效合成活性物质倍半萜奠定基础。 最后，根据转录组测序数据，筛选并成功克隆了2个倍半萜合酶基因AlTPS3，AlTPS4。为验证基因功能，通过重组质粒分别在酿酒酵母SUE/erg9和农杆菌GV3101中表达，重组成功的GV3101对本氏烟草进行渗透进而瞬时表达目的基因。结果发现，AlTPS3编码目的蛋白定位于胞质和叶绿体，AlTPS4编码的蛋白质定位于胞质，且在酿酒酵母中AlTPS3、AlTPS4分别表现出了橙花叔醇合酶和大根香叶烯A合酶的催化活性。因此将AlTPS3、AlTPS4分别命名为AlNES、AlGAS。同时，发现这两个基因在突变型茅苍术中的表达量常常高于野生型茅苍术，说明突变型茅苍术的倍半萜合成更加活跃，这在生化合成途径上进一步验证了突变株能够高效合成倍半萜的生化机制。 本论文从一株茎提前发育的突变型茅苍术快速生长、高效合成倍半萜的现象着手，比较光合作用、碳中心代谢途径、植物内源激素的差异，结合转录组和蛋白质组数据进行系统分析，并对倍半萜合成关键基因进行了表征和表达量的比较，多方面、多层次地探究突变型茅苍术的优势原因。这不仅为茅苍术种质资源优化提供了新思路，也为茅苍术倍半萜合成机制的阐释和完善提供了一定的理论基础。
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