摘要
水稻是世界上重要的粮食作物，也是研究单子叶植物分子生物学的模式生物。水稻的生长发育经常受到冷害、高温、干旱、盐等非生物胁迫的影响，因此研究水稻的生长发育调控机制和抗逆境胁迫就显得尤为重要。大量的数据表明，锌指蛋白作为一种可结合Zn2+并且自我折叠成手指状的转录因子，大多包含特有的QALGGH保守结构，在调控植物生长发育及响应非生物胁迫中起到重要作用。其中植物C2H2型锌指蛋白则是研究较广泛且较为明确的一种。此前我们通过全基因组测序得到一个新型C2H2型锌指蛋白基因OsREF6。本研究以粳稻日本晴为材料，对C2H2型锌指蛋白基因OsREF6进行基因克隆和功能研究，旨在探究其在水稻生长发育以及应对非生物胁迫中的作用，对于揭示C2H2型锌指蛋白对水稻生长发育的调控机制以及抗逆性水稻品种的选育具有重要意义，为将来利用锌指蛋白基因提高作物应对非生物胁迫能力提供更多的参考资料。主要研究结果如下： 1、以日本晴水稻为材料，克隆得到了一个水稻C2H2型锌指蛋白基因OsREF6。经国家水稻数据库查询可得该基因全长10016bp，CDS长4107bp，具有7个外显子区域，其余为内含子。对其进行生物信息学分析发现，水稻OsREF6与拟南芥AtREF6亲缘关系较近，其次是芥菜BjREF6。 2、RiceXPro数据和定量PCR分析显示，OsREF6在水稻各个时期各个部位均有不同程度的表达，花中表达量最高，其次是根、穗、内稃、外稃、叶等部位。切片结果显示OsREF6在根部的表皮、皮层、木质部薄壁细胞以及维管组织中均有表达。对OsREF6在4℃低温处理下的表达量进行分析，发现OsREF6的表达量随着处理时间的增加而增多，36h到达顶峰，随后逐渐下降。表明OsREF6响应低温诱导。 3、OsREF6敲除突变体种子萌发后的生长会随着甘露醇浓度的增加而变慢。利用CRISPR/Cas9基因敲除技术得到3种不同突变类型的纯合突变植株ref6-1、ref6-2与ref6-3。不同浓度的甘露醇对敲除突变植株萌发处理表明：在正常生长条件下，OsREF6敲除突变体种子萌发后的生长速度与野生型一致，当培养基中加入相同浓度的甘露醇时，OsREF6敲除突变体的生长速度明显慢于野生型，并随甘露醇浓度的增加，生长速度会更慢。表明OsREF6缺失突变会影响甘露醇胁迫条件下水稻萌发后的生长速度。 4、OsREF6缺失突变降低了水稻的抗寒性。4℃低温处理后，OsREF6敲除突变植株的存活率明显低于野生型，冷害程度高；分别测定了CAT、POD、SOD这些抗氧化酶活性。分析酶的活性发现，OsREF6敲除突变体水稻植株CAT和POD的活性显著低于野生型，而SOD的活性突变体则显著高于野生型。所以，通过趋势我们认定OsREF6缺失突变会导致水稻的抗寒性降低。 5、OsREF6缺失突变对水稻的叶形及籽粒大小等农艺学性状产生显著性影响。分析水稻成熟期野生型、OsREF6敲除突变体植株农艺学性状，显示OsREF6敲除突变体的株高、每穗穗粒数、有效穗数均低于野生型，但穗长、剑叶长、剑叶宽、粒长、粒宽、千粒重均高于野生型。在育性方面OsREF6敲除突变体并未受到显著影响。OsREF6也影响水稻叶片宽度和粒重：对水稻成熟期野生型、OsREF6敲除突变体植株剑叶进行比较，发现OsREF6敲除突变体的剑叶明显宽于野生型，石蜡切片观察发现，OsREF6敲除突变体剑叶的大、小维管束数量明显增多，并且体积增大，进一步说明OsREF6基因对水稻的生长发育起到调控。 6、对稻米品质分析发现，OsREF6敲除突变体种子垩白比野生型更多。电镜扫描结果显示，OsREF6敲除突变体的淀粉颗粒较野生型更为松散。同时OsREF6敲除突变体种子的淀粉、直链淀粉、蛋白质以及脂肪含量与野生型相比有明显的变化。该结果显示OsREF6会干预到水稻种子的形成，调控水稻植株的生长。
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