摘要
葡萄柚籽提取物（Grapefruitseedextract，GSE）具有良好的广谱抑菌性能。然而，水溶性低，有特殊气味等问题限制了它更为广泛的应用。因此，本实验尝试将其制备成纳米乳液解决上述问题。目前，将GSE制备成葡萄柚籽提取物纳米乳液（Grapefruitseedextractnanoemulsion，GNE）并将其应用于抑制有害菌、生物菌膜以及相关抑菌机制的研究尚未见报道。本文采用高能辅助乳化法制备GNE，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对象，研究GSE和GNE对两种细菌的抑制效果，进一步从细菌细胞膜完整性、细胞壁完整性及细胞微观形态变化探究抑菌机制。最后，研究GSE和GNE对两种细菌生物菌膜形成的抑制和已形成菌膜的消除效果。本研究将为改善GSE的应用局限性、开发新型纳米乳液、推广GNE在食品工业中的实际应用提供科学思路。具体研究内容和结果如下： 1.葡萄柚籽提取物纳米乳液的制备与表征 采用高能辅助乳化法制备了GNE。通过染色法、透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope，TEM）、粒径仪、傅里叶红外光谱（Fouriertransforminfrared，FTIR）对其表征。结果显示，GNE为O/W型纳米乳液，新鲜制备的GNE粒径小、液滴形态圆润、分散均匀。GNE的稳定性良好，放置5d后纳米液滴未发生大规模团聚。 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为实验对象，采用平板计数法测定了GSE、GNE对大肠杆菌和金葡菌的最小抑菌浓度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）及对两种菌的生长抑制情况。结果显示，GSE（或GNE）对大肠杆菌和金葡菌的MIC值分别是1.4%（1.2%）、0.8%（0.6%），GNE对两种菌的MIC均低于GSE。动态抑菌试验发现，培养初期，GSE和GNE对两种细菌的抑菌效果无显著差异，6h以后GNE抑菌效果强于相同浓度的GSE。冻干后GNE抑菌能力与新鲜制备的GNE无显著性差异。 2.葡萄柚籽提取物及纳米乳液抑菌机制研究 通过碱性磷酸酶含量变化可知，GSE和GNE严重破坏了大肠杆菌细胞壁的完整性，但对金葡菌破坏相对较小。蛋白质、核酸浓度以及电导率的变化表明GSE和GNE严重破坏了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的选择透过性和完整性。TEM发现处理组的菌体出现变形和破损。结果表明，GSE和GNE处理后有害菌的细胞壁和细胞膜受损、胞内物质外流，抑制了细胞的正常生长代谢，从而起到杀菌的作用。 3.葡萄柚籽提取物及纳米乳液抑制菌膜研究 通过菌膜黏附菌数变化、胞外聚合物（Extracellularpolymericsubstances，EPS）含量以及微观结构观察探究GSE和GNE对大肠杆菌和金葡菌生物菌膜形成的抑制作用，进一步比较GSE和GNE对两菌已形成菌膜（单种菌膜和混合菌膜）的消除效果。结果显示，1/2MICGSE和GNE可以抑制两菌单种菌膜形成时黏附菌数和EPS产生，且对金葡菌的抑制作用更强。扫描电子显微镜（Scanningelectronmicrocopy，SEM）和激光共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）微观结构也发生类似变化。GSE和GNE对已形成菌膜也有良好消除效果，且对金葡菌菌膜的消除作用更强，但混合菌膜的抗性强于单种菌膜。GSE和GNE比较发现，GNE抑制菌膜形成及消除菌膜均强于GSE，1/2MICGNE作用120h时两菌菌膜形成量均比GSE组少0.6lg（CFU/cm2）以上，1.8%的GNE对菌膜的消除率比GSE增加7.7%~27.2%。
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