摘要
金线莲（Anoectochilusroxburghii）为兰科多年生草本植物，具有丰富的营养成分，是我国珍贵的天然药材。金线莲对四氯化碳（CCl4）所致的肝损伤、慢性乙型肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病等均有显著治疗作用。然而，目前对金线莲的有效活性成分和保肝药理机制的研究仍然不够深入。本论文运用超高效液相色谱-飞行时间质谱技术对金线莲的化学成分进行解析，开展金线莲提取物和金线莲苷的动物体内药效学研究，并采用网络药理学和非靶向代谢组学相结合的方式深入探究金线莲保肝作用机制，具体内容如下： 一、金线莲化学成分分析使用UPLC-Q-TOF/MS技术，结合MassLynx软件以及SciFinder等数据库对金线莲的化学成分进行了表征，共鉴定出45个化学成分。按照化合物类型分类，黄酮类成分24个、糖类成分7个、氨基酸类成分4个、核苷类成分3个、有机酸类成分5个和其他类成分2个。其中，首次从金线莲中鉴定出异槲皮苷、6-O-阿魏酰葡萄糖、大黄素、葡糖基芦丁、蛇床子素等多个化合物。 二、金线莲保肝网络药理学研究通过对金线莲的化学成分分析和文献调研，建立金线莲化学成分数据库。利用SwissTargetPrediction数据库和Similarityensembleapproach数据库获得860个金线莲化学成分靶标。以“hepaticinjury”为关键词，在DisGeNET和GeneCards数据库中检索得到1664个肝损伤相关靶标。筛选得到两者共有靶标302个。将302个共有靶标输入Cytoscape软件中，绘制出“中药-成分-靶标-疾病”交互作用网络图谱。分析网络发现，关联度最高的共有靶标包括SRC、MAPK3、MAPK1、TP53、STAT3、AKT1、PIK3R1及HSP90AA1等。节点度较高的成分包括槲皮素、亚油酸、异鼠李素、亚麻酸甲酯、3''，7-二-O-甲基槲皮素和金线莲苷等。KEGG富集结果显示，金线莲治疗肝损伤的过程与Rap1信号通路、催乳素信号通路、乙型肝炎、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、蛋白聚糖、神经营养因子信号通路等生物学过程相关。 三、金线莲保肝护肝药效学研究金线莲提取液经浓缩后，对大鼠进行灌胃预保护，再进行肝损伤造模，通过测定血清肝功能指标、氧化应激指标和观察肝脏组织的病理生理变化，对金线莲的保肝护肝疗效进行了评价。结果显示：与模型组相比，金线莲组血清肝功能指标AST、ALT和ALP升高，肝组织匀浆中氧化应激指标SOD活性升高，MDA含量显著降低，HYP和CVF显著降低。染色结果显示：金线莲实验组肝纤维化程度得到明显改善，肝窦大小均匀，未见扩张，未见明显肝细胞坏死，只有极少的炎性细胞和个别肝脏细胞有轻微的脂质沉积。与模型组相比，金线莲实验组的肝组织匀浆中SRC、MAPK3、MAPK1、TP53和STAT3降低，AKT1、PIK3R1和HSP90AA1升高，差异具有统计学意义。金线莲可能通过改变细胞膜通透性，清除细胞内自由基，减少炎症反应，影响基因表达调控，从而对肝损伤起到保护的效果。 四、金线莲苷保肝护肝药效学研究金线莲苷作为金线莲的主要化学成分之一，对金线莲的保肝疗效至关重要。通过对肝损伤模型大鼠灌胃金线莲苷单体成分进行预保护，考察金线莲苷是否为金线莲的保肝活性成分。结果表明：金线莲苷能增强大鼠的抗氧化能力并调整脂质代谢紊乱。此外，金线莲苷可以抑制四氯化碳引起的肝细胞凋亡，减少氧化应激，缓解肝细胞死亡。金线莲苷具有保肝护肝方面的疗效，是金线莲保肝护肝的有效活性成分之一。 五、金线莲保肝护肝血清代谢组学研究对空白组、模型组、阳性对照组和金线莲实验组的血清样品进行前处理后，建立稳定、可靠、重复性好的气相色谱-质谱联用方法，对血清样本进行分析。将所得气质联用数据运用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）两种数学模型进行拟合分析，发现肝损伤模型大鼠给药治疗后内源性代谢物变化规律，获得差异生物标记物。与空白组相比，模型大鼠血清样品中各种代谢物均发生了显著变化，特别是谷胱甘肽代谢、丙氨酸、乙醛酸和二羧酸代谢、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等相关代谢通路发生了紊乱，不同剂量的金线莲实验组间均发生显著性变化有丙氨酸、丙酸、乳酸、甘油、苏氨酸及甘氨酸等15个内源性代谢物。其中，丙酸、甘油和丝氨酸等7个代谢物水平显著性上调，D-葡萄糖、丙氨酸、苏氨酸和乳酸等8个代谢物水平显著性水平下调。与模型组相比，经过金线莲预保护的肝损伤模型大鼠血清样本中的这些代谢物水平发生了一定幅度的改善，数值向空白组水平靠近，这说明金线莲预保护减轻了肝损伤水平。 综上所述，本文采用代谢组学和网络药理学相结合的研究手段对金线莲预防肝损伤机理进行了深入探讨，揭示了金线莲药效物质基础。以SD雄性大鼠为研究对象，灌胃给予金线莲提取物和金线莲苷十天，明确了金线莲及金线莲苷的保肝疗效；网络药理学研究表明金线莲黄酮类、糖苷类及挥发油类成分通过作用于多靶点，多途径协同预防肝损伤；代谢组学研究显示金线莲保肝护肝主要是通过谷胱甘肽代谢及氨基酸代谢来实现。该课题为金线莲药效机制及开发利用等研究提供理论依据。
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