摘要
双酚A(BisphenolA,BPA)作为一种典型的环境内分泌干扰物(Endocrinedisruptingchemicals,EDCs)，因其具有增塑剂的特性而被广泛应用于食品包装、医疗器械等领域。由于BPA的化学结构与己烯雌酚类似，故具拟/抗雌激素和抗雄激素活性。已有研究表明BPA可影响脑的发育和突触可塑性，导致个体的认知功能异常、行为紊乱、社会能力受损。 社会识别是指动物在遇到不同熟悉程度的个体后会调整其自身行为,以便恰当互作、等级建立和其他社会关系，它是所有社会行为和社会关系的基础。本实验室前期研究发现青春期BPA暴露通过影响社会识别进而损害成年雄鼠的社会能力，出现诸如异性社会交互减少、社会探究减弱和攻击意识异常等现象。已有研究表明，神经肽加压素(AVP)和催产素(OT)活动在社会识别中起重要调节作用，而性激素可通过调控神经肽影响动物的社会识别功能。BPA已被证实可与雌激素受体结合，通过雌激素受体(ER)依赖的信号通路发挥激动剂或拮抗剂的作用。此外，BPA还可干扰二氢睾酮与雄激素受体(AR)结合的稳态，拮抗AR介导的代谢通路。因此推测BPA可能通过干扰性激素调控脑内神经肽AVP/OT系统而影响社会识别。 本实验以雄性小鼠为模型，通过c-fos表达情况确定青春期BPA暴露后社会识别环路中的靶向脑区，并根据这些关键脑区的性激素受体(ERα、ERβ和AR)以及神经肽系统(AVP、OT、OTR和V1aR)的表达变化情况，结合转录组学分析相关信号通路基因差异表达水平，探究BPA对社会识别的影响机制。 研究方法 清洁级3周龄ICR雄鼠适应1周后，随机分成三组，从第五周开始分别给予溶媒对照和BPA(0.4,4mg/kg)暴露21天(Postnatalday,PND29-PND49)。从第13周开始，异性同龄小鼠进行40min社会刺激2hr后，免疫荧光比较社会识别环路相关脑区(副嗅球(AOB)、侧隔(LS)、终纹床核(BNST)、内侧杏仁核(MeA)下丘脑室旁核(PVN)、视上核(SON)和海马(HIP))的c-fos表达，以确定对BPA敏感的靶向脑区，并对筛选出的脑区(LS、MeA、PVN和HIP)进行OT和AVP免疫反应(OT-ir、AVP-ir)、OT和AVP受体(OTR和V1aR)免疫反应(OTR-ir、V1aR-ir)、雌激素受体和雄激素受体(ERα-ir、ERβ-ir、AR-ir)免疫反应神经元数的免疫组化分析，最后转录组分析社会识别关键脑区MeA、PVN和HIP的差异表达基因，探讨BPA干扰性激素和神经肽AVP/OT调节社会识别环路的信号通路和分子机制。 研究结果 1社会识别回路中对BPA敏感脑区的确定 免疫荧光检测结果显示，接受社会刺激后，社会识别相关脑区(AOB、PVN、MeA、LS、BNST、HIP)的c-fos-ir神经元数量均有不同程度的增加，青春期BPA暴露明显减少社会刺激后PVN、MeA、LS、HIP脑区的c-fos-ir神经元数量，而其他脑区改变不明显。与对照组相比，0.4mg/kgBPA显著下调LS和MeA脑区c-fos-ir细胞数(Plt;0.01;Plt;0.01)，而4.0mg/kgBPA导致LS、PVN、MeA和HIP脑区c-fos-ir均显著下降(Plt;0.05;Plt;0.001;Plt;0.001;Plt;0.001)，提示社会识别环路中，LS、MeA、PVN和HIP是对BPA敏感的靶向脑区。 2性激素受体 免疫组化检测结果显示，接受社会刺激后，青春期BPA暴露显著上调LS、MeA(4mg/kg)和PVN脑区的AR表达(Plt;0.001;Plt;0.001;Plt;0.001;Plt;0.01;Plt;0.05)；显著下调PVN脑区(Plt;0.05;Plt;0.001)但显著上调HIP脑区的ERβ表达(4mg/kg，Plt;0.01)；显著上调PVN(4mg/kg，Plt;0.01)和MeA(0.4mg/kg，Plt;0.01)脑区;但下调HIP脑区ERα表达(Plt;0.01)。提示青春期BPA暴露会引起LS、MeA和PVN脑区的AR-ir表达上调，并脑区特异性和剂量依赖性的改变雌激素对社会识别相关PVN、MeA和HIP脑区ERα/β水平的调节作用。 3神经肽及相应受体 免疫荧光/组化结果显示，接受社会刺激后，青春期BPA暴露显著下调LS(AVP纤维投射密度)、PVN和MeA脑区的AVP-ir细胞数(Plt;0.001;Plt;0.001;Plt;0.001;Plt;0.001;Plt;0.05;Plt;0.01)、LS、PVN(4mg/kg)和HIP脑区的V1aR-ir细胞数(Plt;0.01;Plt;0.001;Plt;0.05;Plt;0.001;plt;0.001)，但显著上调MeA脑区的V1aR-ir细胞数表达(Plt;0.01;Plt;0.001)。而仅4mg/kgBPA暴露显著下调MeA和HIP脑区的OTR-ir细胞数(Plt;0.001;Plt;0.05)。提示青春期BPA暴露会剂量依赖性和脑区特异性地影响雄性小鼠社会识别相关LS、PVN、MeA和HIP脑区神经肽，特别是AVP系统水平。 4转录组学结果 考虑到下丘脑、杏仁核、海马在社会识别中的关键作用，进一步对这3个脑区进行转录组学分析，检测BPA暴露后各脑区的差异表达基因，探讨性激素和神经肽AVP/OT参与社会识别的信号通路变化。结果表明，与对照组相比，0.4和4.0mg/kgBPA暴露后，杏仁核脑区分别有187个和161个基因出现差异表达，海马脑区分别有1个和249个基因差异表达，下丘脑有5个和7个差异表达基因。其中高剂量BPA暴露海马和杏仁核共有21个相同的差异表达基因，且均为特异性下调；而下丘脑与杏仁核之间仅有2个相同的差异表达基因，下丘脑与海马之间没有相同的差异表达基因。以上结果提示社会识别神经环路各脑区对青春期BPA暴露的敏感性不同，其中杏仁核最为敏感；同时，BPA引起的差异表达基因在杏仁核与海马脑区之间的功能关联度及相似程度较高，而下丘脑与杏仁核或海马之间的功能关联度及相似程度较低。 通过KEGG分析，发现海马和杏仁核脑区的差异表达基因主要富集在钙信号通路、催产素信号通路和神经活性配体-受体相互作用的过程，下丘脑差异表达基因主要富集在寿命调节途径；而GO分析显示海马和杏仁核脑区差异表达基因主要富集于质膜、突触和神经元投射等生物学过程，下丘脑差异表达基因主要存在于真核翻译起始因子、剪接体复合体等功能实现过程。以上结果提示社会识别环路中杏仁核和海马脑区与突触结构和功能相关基因的差异表达可能是青春期BPA暴露影响社会识别的主要原因，而下丘脑相关基因的差异表达主要导致有害物代谢途径的抑制。 基于前期发现青春期BPA暴露改变脑内性激素及神经肽AVP/OT系统活动，针对其介导的信号通路，本研究发现，青春期BPA暴露下调HIP(4mg/kg)脑区中AVP/OT及受体的基因表达，并显著下调Hsd11b1、Akr1c18、Gnas、Adcy1和RXRα基因表达(Qlt;0.05;Qlt;0.05;Qlt;0.05;Qlt;0.001;Qlt;0.05)，显著上调Itpr1和TGF-α基因表达(Qlt;0.05;Qlt;0.05)。青春期BPA暴露下调MeA脑区AVP和OT/OTR的基因表达、上调V1aR表达的同时，显著下调Camk2a，Pde1a和Prkca基因表达(Qlt;0.05;Qlt;0.05;Qlt;0.05;Qlt;0.001;Qlt;0.05;Qlt;0.05)、上调Itpr1(4mg/kg)、Adcy2和Plcb4基因表达(Qlt;0.05;Qlt;0.05;Qlt;0.05;Qlt;0.001;Qlt;0.05)。以上结果提示青春期BPA暴露通过影响海马脑区性激素及神经肽AVP/OT系统激活Gi和Gq介导的信号通路，改变内质网离子稳态，并与核启动类固醇通路中的生长调节因子TGFα和RXRα共同影响海马细胞结构和突触可塑性；而杏仁核的性激素和神经肽AVP/OT共同激活Gs和Gq介导的信号通路，引起胞内Ca2+下调，抑制突触相关钙调蛋白作用，信号级联效应减弱，信号传导功能受损。 结论 青春期BPA暴露可通过脑区特异性地干扰脑内雌、雄激素活动，扰乱其对神经肽特别是AVP系统对雄性社会识别关键脑区HIP、MeA和PVN的调控作用而影响雄鼠成年后的社会识别功能。在此过程中，BPA不仅抑制LS、MeA和PVN中AR参与的信号通路，并脑区特异性地紊乱HIP、MeA和PVN的ERα/β表达，进而干扰AVP/OT系统介导的cAMP和PI3K信号通路，特异性地影响社会识别关键脑区海马的细胞突触可塑性和杏仁核的信号级联放大效应，从而损伤社会识别。
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