摘要
L-苹果酸常作为添加剂或前体物质广泛应用于食品、日化工业、制药和医疗保健行业中。苹果酸的化学合成技术在20世纪60年代发展起来，至今仍在使用，但该反应产生的是外消旋型DL-苹果酸，而不是L-苹果酸。微生物发酵法生产L-苹果酸由于其发酵周期较长、发酵过程中需要加入中和剂、副产物较多导致下游分离提纯成本高等因素的限制，并没有被广泛应用于L-苹果酸的生产。酶催化法制备L-苹果酸具有反应条件温和，产品纯度高等优点，是目前最主要的制备方法。 本文通过基因工程技术构建了表达延胡索酸酶的重组大肠杆菌，开发了以Escherichiacoli（E.coli）BL21(DE3)为蛋白表达宿主，表达出一种耐高温的延胡索酸酶，以富马酸为起始底物，经耐高温延胡索酸酶催化合成L-苹果酸的工艺路线。该路线与已被文献报道的酶催化法制备L-苹果酸相比具有操作简单、生产周期更短、副产物少、产率高等优点。本文具体工作内容如下： （1）分别克隆了来自Saccharomycescerevisiae（S.cerevisiae）的延胡索酸酶基因FUM1和来自ThermusthermophilusHB8的延胡索酸酶基因FumCth，构建了重组表达质粒pET28a-FUM1和pET28a-FumCth，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行表达。在酶催化反应过程中发现E.coliBL21(DE3)菌体自身会代谢L-苹果酸，导致平衡产率低。因此进一步对两种延胡索酸酶分别进行酶催化反应研究，提升平衡产率。对E.coliBL21(DE3)-pET28a-FUM1进行了树脂固定化等改造后进行酶催化反应，平衡产率并未得到提高，依旧只有77%左右。由于FumCth基因来源于嗜热菌，因此将E.coliBL21(DE3)-pET28a-FumCth在60℃热处理30min后进行酶催化反应，反应结果表明60℃热处理30min，目的蛋白FumCth并未失活，蛋白表达宿主E.coliBL21(DE3)中会代谢L-苹果酸的杂酶失活。简单的热处理使得平衡产率提升至94%。 （2）基于对两种延胡索酸酶酶催化反应的研究，选择FumCth作为酶催化反应过程中的研究对象。考察了该酶的酶学性质：最适反应pH为7.0；最适反应温度为70℃；最适储存pH为7.0；该酶在60℃保存12h酶活性损失较小，热稳定性较好；金属离子对酶活性几乎没有影响；最大反应速率Vmax=0.42mmol/s；米氏常数Km=15mM，与底物亲和性良好；kcat=329.15s-1，酶催化活性较高。 （3）建立了高温全细胞催化法制备L-苹果酸的工艺路线。在不同底物浓度、不同反应温度、不同反应pH下进行酶催化反应探索。将全细胞催化反应条件优化后，建立了5L规模的L-苹果酸转化体系：富马酸200g/L，用氨水调pH至7.0，添加0.5%60℃热处理30min后的延胡索酸酶重组细胞于60℃反应。60min即可完成酶催化反应，而传统的酿酒酵母表达延胡索酸酶进行酶催化反应生产L-苹果酸反应周期长达36h。富马酸转化率约为80.0%，L-苹果酸产率约为80.0%，平衡产率高达100%。目前小试酶催化实验结果表明，该工艺路线具有工业化制备L-苹果酸的潜力。 （4）建立了用阴阳离子交换色谱柱分离提取L-苹果酸的方法。与传统的钙盐沉淀法提取L-苹果酸相比，优势如下：提取出来的成品中L-苹果酸含量更高；收率更高为99.02%；无需加入碳酸钙，没有产生硫酸钙废物，无需对其进行处理。选用的阴阳离子交换树脂能够重复使用，大大节约了提取成本。具体提取方法如下：选用强酸性阳离子交换树脂HZ001，上样流速为13mL/min，用纯水顶洗料液至出料中L-苹果酸含量低于1g/L，所需纯水体积为1400mL，流速13mL/min；再选用弱碱性阴离子交换树脂HZX2215，上样流速为15mL/min，用纯水顶洗料液至出料中L-苹果酸含量低于1g/L，所需纯水体积为1575mL，流速15mL/min；最后经过浓缩后诱导结晶得到固体L-苹果酸成品179.38g，总收率为99.02%，L-苹果酸含量≥99%，残渣量＜0.1%，产品质量合格。
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