摘要
非生物胁迫对甘蓝型油菜的生长造成严重的危害。植物激素脱落酸（ABA）在植物抗逆过程中发挥了关键作用。ABF（ABA-responsiveelementbindingfactor）转录因子在植物ABA信号转导途径中的扮演着重要的角色，但其在油菜耐非生物逆境过程中的功能尚待揭示。本研究通过生物信息学、qRT-PCR和转基因等技术，初步研究了BnaABFs基因在甘蓝型油菜中的功能，为系统揭示油菜非生物逆境抗性的分子机理奠定了理论基础。主要结果如下： 1．BnaABFs家族成员鉴定和进化分析。通过生物信息学技术，在甘蓝型油菜参考基因组中找到4个BnaABFs基因：BnaABF1、BnaABF2、BnaABF3和BnaABF4，它们分别包含2个、2个、3个和6个同源拷贝。利用Tbtools软件构建甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等6个物种以及甘蓝型油菜9个品种系统进化树。BnaABFs基因在不同的甘蓝型油菜品种中差异不大，且与其对应二倍体祖先种直系同源基因相似，结果表明BnaABFs功能比较保守。 2．BnaABFs组织特异性表达分析。不同的BnaABFs基因和同源拷贝在不同的组织中表达模式不同。BnaABF1的2个同源拷贝均在茎、叶和花蕾中优势表达。BnaABF2的2个同源拷贝中BnaA10.ABF2主要在茎、叶和花蕾中优势表达，BnaC06.ABF2是BnaABFs中相对表达量最高的拷贝。BnaABF3有3个同源拷贝，在所有组织中均有表达，其中BnaC07.ABF3和BnaUN.ABF3分别在种子和叶片中相对表达量较高。BnaABF4有6个同源拷贝，其中BnaC05.ABF4主要在花蕾中优势表达，在茎、种子和叶中的表达量也比其它拷贝稍高。 3．BnaABFs受ABA诱导表达。利用qRT-RCR技术检测甘蓝型油菜Westar在ABA处理下BnaABFs基因的表达水平，结果表明：BnaABF1、BnaABF2、BnaABF3和BnaABF4基因的所有拷贝均受ABA的诱导，但响应时间及程度有所不同。 4．BnaABFs基因敲除和过表达转基因材料创建。共构建5个CRISPR载体转化Westar，其中4个分别敲除BnaABF1、BnaABF2、BnaABF3和BnaABF4基因的所有同源拷贝，另1个同时敲除BnaABF2和BnaABF3基因的所有拷贝。另外，挑选ABA诱导上调表达的4个基因BnaA06.ABF1、BnaC06.ABF2、BnaC07.ABF3和BnaA05.ABF4分别构建其超表达载体，转化Westar。最终获得188个敲除和73个超表达T0代单株。 5．转基因植株阳性和编辑情况检测。T0代转基因材料的阳性率为66.67%~100%。利用Hi-TOM检测T0代敲除材料阳性苗的编辑情况，发现5个CRISPR载体的编辑效率在32.35%~85.94%之间，靶点编辑以插入和缺失两种突变类型为主，替换突变效率最低。T1代与T0代编辑情况一致且通过分离得到了纯合突变体。此外，T1代分离出了T-DNAfree单株，但多为杂合单株且存在多种编辑形式。 6．超表达植株BnaABFs下游基因表达量测定。采用qRT-PCR技术对甘蓝型油菜超表达转基因阳性植株进行BnaABFs下游干旱胁迫相关基因BnaC03.RD29A、BnaA03.RD29B和BnaC09.RDAB18表达量的测定。与WT相比，BnaABFs超表达植株中这些下游基因的表达并无显著差异。 7．转基因株系表型鉴定。对T1代BnaC07.ABF3超表达株系OE3-1、OE3-2、OE3-3进行干旱胁迫处理。结果显示超表达植株抗旱性增强，表明BnaC07.ABF3基因在油菜应对干旱胁迫过程中发挥重要的功能。由于BnaABFs基因同源拷贝数目较多，T1代获得的转基因植株多为杂合突变体，后续将对T2代纯合突变体进行表型考察。
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