摘要
核桃树腐烂病在新疆各个种植区均有不同程度的发生，导致核桃树树皮腐烂坏死、树势衰弱，目前已对核桃产业可持续健康发展构成严重威胁。由于该病害在防治过程中大量使用化学药剂，容易造成严重的环境污染和农药残留，同时上升到植物病原菌抗药性问题。本研究针对新疆阿克苏地区的核桃树腐烂病进行病原菌的分离，开展致病性测定，并经形态学和分子生物学相结合的方法，明确核桃树腐烂病病原菌种类和优势病原菌群的区域性特征。同时，以核桃树腐烂病的优势病原菌Cytosporachrysosperma为靶标菌，采用组织分离法从健康核桃树皮中分离得到对C.chrysosperma具有明显抑菌效果的生防细菌，命名为S23，通过形态学、Biolog快速鉴定和分子生物学明确其分类地位。进一步通过菌株S23发酵滤液测定其对菌丝生长的抑制作用和抑菌稳定性，最后采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）技术相结合的手段初步探究生防微生物S23的抑菌机理。主要研究如下： 1．从核桃树腐烂病病害枝条样品分离纯化获得229株真菌菌株，经过形态学和分子生物学鉴定结果，将真菌菌株分为3个类群，分别为C.chrysosperma、Cytosporanivea和Cryptosphaeriapullmanensis。通过致病性测定和分子生物学鉴定结果表明C.chrysosperma、C.nivea、C.pullmanensis是引起新疆阿克苏地区核桃树腐烂病的病原菌，其中C.chrysosperma为阿克苏地区各核桃产区的核桃树腐烂病的优势菌群，其分离频率为89.08%。 2．以C.chrysosperma为靶标菌，对分离自健康核桃树皮的79株疑似生防菌株进行平板对峙法进行初筛和复筛，筛选出对核桃树腐烂病菌具有良好抑制作用的生防菌S23，其初筛和复筛的防效分别为83.73%和85.88%。离体枝条试验表明，S23对核桃树腐烂病具有一定的保护效果，相对防效为82.14%。并通过抑菌谱测定发现，S23对C.mali和C.chrysosperma有较强的抑制作用，抑制率分别达到86.67%和83.73%，同时发现S23的抑制效果具有高效的广谱性，对病原菌Cytosporaleucostoma、Cytosporamelnikii、Cytosporatritici等菌丝生长具有较强的抑制作用，抑制率均达到80%以上。故选择菌株S23为研究对象。经过形态学、Biolog微生物自动鉴定和16SrDNA序列相结合方法鉴定菌株S23为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。 3．初步探究生防菌S23的抑菌机理。首先测定菌株S23的生长曲线，发现菌株在培养10~16h时菌株进入稳定期，菌株量达到最大值。进一步评价S23发酵滤液对C.chrysosperma菌丝生长的抑制效果，发现随着培养基中发酵滤液的含量越高，抑菌效果越强。当发酵滤液含量为10%时，对C.chrysosperma菌丝生长具有显著的抑制效果，其抑制率为99.69%。发酵滤液的抑菌稳定性研究发现，S23对温度和紫外线均具有良好的稳定性，在40~80℃处理30min和紫外线照射60min的条件下仍能保持良好的抑菌活性，能够适应核桃树生长环境。通过扫描电镜和透射电镜观察S23发酵滤液对C.chrysosperma菌丝的形态变化和超微结构，菌丝出现断裂现象，随作用时间延长，菌丝彻底瓦解；处理后的病原菌细胞结构生长异常，细胞扭曲变形，出现质壁分离现象，细胞结构紊乱。
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