摘要
罗汉果[Siraitiagrosvenorii(Swingle)C.Jeffery]是我国特有的一种药食同源植物，其主要活性物质为葫芦烷型三萜糖苷类化合物——罗汉果皂苷（mogroside,MG），是一种天然低热量食品甜味剂，具有甜度极高、毒性小、热量低、不升高血糖的特点，近年来，多个研究组报道了MG的降血糖和抗糖尿病作用，但其作用机制和代谢规律仍不明确，限制了MG的开发和应用。为此，本文首先分析了罗汉果皂苷提取物（mogrosideextract，MGE）的主要化学组成、体外抗氧化、抗糖基化和降血糖作用，以寻找MG可能的作用靶点。随后，利用高脂饲料（high-fatdiet,HFD）联合链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）建立2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）小鼠模型，研究了MG对T2DM小鼠胰岛素抵抗的干预和糖脂代谢的调节作用，及AMPK（Adenosine5?-monophosphate-activatedproteinkinase）信号通路的激活作用，通过高糖应激的HepG2细胞模型，探讨MG激活AMPK的构效、剂效和时效关系，及其调节糖脂代谢的作用机制。最后，采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS）方法对MG活性单体11-氧-罗汉果皂苷Ⅴ（11-oxo-mogrosideⅤ，11-O-MGⅤ）在体内的代谢动力学及主要代谢产物在组织中的分布进行了研究。主要研究结果如下： 1.MGE体外抗氧化、抗糖基化作用和降血糖活性 MGE中的总皂苷含量达到80.14%，含有少量酚类和黄酮类化合物，MG单体中，MGⅤ（mogrosideⅤ）含量最高，其次为11-O-MGⅤ和MGⅥ，含量分别为44.52%、7.34%和4.58%，其余单体含量均低于1%。体外抗氧化实验显示，MGE具有一定的·OH自由基清除活性和较弱的DPPH和ABTS有机自由基清除能力，其IC50值分别为472.9μg/mL、1268μg/mL和1227μg/mL。此外，MGE还具有一定的氧自由基吸收能力（oxygenradicalabsorbancecapacity，ORAC），达到851.8μmolTE/g，而对Fe2+螯合能力和还原能力较弱。体外抗糖基化实验表明，与模型组比较，高剂量（1mg/mL）MGE作用4周后，荧光AGEs（advancedglycationendproducts）强度、果糖胺水平、蛋白羰基含量、β淀粉样交联蛋白含量和CML（Nε-(carboxymethyl)lysine）水平分别降低了51.0%、38.0%、26.4%、49.1%和55.4%（P值均小于0.05），而蛋白巯基水平上升了74.4%（P＜0.05）。胃肠道碳水化合物消化酶抑制实验显示，高浓度MGE（5000μg/mL）对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分别为39.2%和25.1%，IC50值均大于5000μg/mL，表现出较弱的抑制活性。以上体外实验结果提示，MGE抗糖尿病的作用可能与其显著的抗糖基化能力相关，许多研究表明体内糖基化产物水平与糖尿病的发生、发展密切相关。 2.MGE体内抗T2DM作用及其对肝脏AMPK信号通路的影响 与模型组比较，MGE干预5周显著改善T2DM小鼠症状，降低肝脏指数和附睾白色脂肪指数，但对小鼠的体重和总能量摄入无明显影响（P＞0.05）。此外，300mg/kgBW（bodyweight）（高剂量）的MGE干预显著降低T2DM小鼠空腹血糖（Fastingbloodglucose，FBG）和血清胰岛素水平及糖化血清蛋白（glycatedserumprotein，GSP）、体内稳态模型评估-胰岛素抵抗指数（homeostasismodelassessment-insulinresistance，HOMA-IR）和血清总甘油三酯（totaltriglyceride，TG）（P＜0.05），同时显著升高胰岛素敏感指数（insulinsensitivityindex，ISI）和高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）含量，增强腹腔葡萄糖和胰岛素耐受能力（P＜0.05）。 蛋白和基因表达实验表明，高剂量MGE能显著激活糖尿病小鼠肝脏AMPK信号通路（与正常组比较，糖尿病组p-AMPKα的相对表达水平为0.48±0.11，高剂量MGE干预组的为1.48±0.22，P＜0.05），下调糖异生关键基因葡萄糖-6-磷酸酶（glucose6-phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK）基因mRNA表达水平，降低肝脏脂质从头合成关键蛋白脂肪酸合成酶（fattyacidsynthase，FAS）蛋白表达水平，以及关键转录因子甾醇调节元件响应蛋白1（sterolregulatoryelement-bindingprotein1，SREBP1）、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（stearoyl-CoAdesaturase-1，SCD-1）和二酰甘油酰基转移酶2（diglycerideacyltransferase2，DGAT2）mRNA水平，且上调脂肪酸氧化关联的关键基因肉碱棕榈酰转移酶1a（carnitinePalmitoyltransferase1a，CPT1a）mRNA表达水平（P＜0.05），同时改善肝细胞多态性，抑制脂质积累和脂肪变性。以上结果清楚表明，MGE能激活AMPK信号通路，而AMPK的活化促进了糖和脂肪的分解代谢，抑制了糖异生和脂质从头合成，增强了脂肪酸氧化，从而改善了T2DM小鼠的糖脂代谢和胰岛素抵抗。因此我们推测MGE可能通过激活肝脏AMPK信号通路，抑制糖异生和脂质从头合成，促进脂肪酸氧化，从而改善T2DM小鼠的糖脂代谢和胰岛素抵抗。 3.MG调节高糖应激HepG2细胞糖脂代谢的作用机制 不同结构的罗汉果皂苷单体（11-O-MGⅤ、MGⅤ、MGⅢE、MGⅣE、SMⅠ）及其苷元均激活高糖应激HepG2细胞AMPK信号通路，其中11-O-MGⅤ的作用最强，且呈现出明显的剂量-效应和时间-效应关系，最佳浓度为10μM，作用时间24h。小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）敲低和AMPK特异性抑制实验表明，11-O-MGⅤ通过激活AMPK通路以调节HepG2细胞的糖脂代谢。对于糖代谢，10μM的11-O-MGⅤ干预24h显著降低G6Pase和PEPCK基因mRNA水平（P＜0.05），抑制葡糖糖生成，并促进葡萄糖摄入，增加糖原积累。对于脂代谢，11-O-MGⅤ（10μM）干预24h后，乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoAcarboxylase，ACC）蛋白磷酸化水平（p-ACC）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα）和CPT1a蛋白表达水平上调，而FAS和SREBP1蛋白表达水平下调，Akt（proteinkinaseB）磷酸化水平无明显变化（P＞0.05）。这些结果表明11-O-MGⅤ对高糖应激HepG2细胞糖异生和脂质合成的抑制作用，以及葡萄糖摄入、糖原积累和脂肪酸氧化的促进作用与AMPK通路的激活紧密相关，而不依赖于胰岛素调节的PI3K（phosphatidylinositol3-kinase）-Akt通路。此外，11-O-MGⅤ处理，抑制高糖应激的HepG2细胞ROS（reactiveoxygenspecies）积累，降低磷酸化c-Jun氨基末端激酶（c-JunNH(2)-terminalkinase，JNK）磷酸化和胰岛素受体底物-1（insulinreceptorsubstrate-1，IRS-1）Ser307磷酸化水平，上调血红素氧化酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）表达水平。尽管AMPK活化与氧化应激相关，但这种效应与11-O-MGⅤ介导的AMPK激活的直接证据，尚需进一步研究。 4.11-O-MGⅤ代谢动力学及代谢产物分析 本文建立并验证了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（ultra-performanceliquidchromatography-triplequadrupoletandemmassspectrometry，UPLC-QqQ-MS/MS）定量分析大鼠血浆11-O-MGⅤ浓度的分析方法，该分析方法具有良好的特异性，线性范围为4-2000ng/mL，定量下限（lowerlimitofquantitation，LLOQ）为4ng/mL，精密度、准确度、稳定性、基质效应、提取回收率以及残留试验、稀释可靠性均达到生物样本分析方法验证和定量检测的要求，并应用该分析方法研究了11-O-MGⅤ的代谢动力学。结果表明口服100mg/kgBW的11-O-MGⅤ，血浆最大浓度为150.4μg/mL，达峰时间0.542h，半衰期1.00h，绝对生物利用率仅有0.056%。经口摄入的11-O-MGⅤ大部分未被小肠吸收，以原形物及其代谢物形式经粪便排泄，吸收的11-O-MGⅤ主要以原形物形式在组织中分布。此外，11-O-MGⅤ还通过去糖基化、加氢、异构化、羟基化、氧化和糖基化反应，在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、尿液、粪便和血浆中形成29种代谢物，主要是去糖基化、加氢和异构化产物。其中粪便、尿液、小肠和肺中的代谢物数量、峰面积显著高于其他组织。
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