摘要
猪捷申病毒（PorcineTeschovirus,PTV）是一种单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科捷申病毒属。目前，该病毒属分为2个种，至少含有17个基因型。临床上，PTVs在不同日龄猪群中广泛存在，对幼龄动物感染性更强，但多以无症状感染为主。一些特定毒株感染后会导致宿主出现繁殖障碍、肺炎、腹泻、脑脊髓炎等临床症状。其中，由PTV1型强毒力毒株引起的高致死性脑脊髓炎（即捷申病）自上世纪40年代开始在欧洲国家流行，给社会经济带来严重负面影响，该病在当时被认为是最危险的动物疾病之一。 2016年8月底，我国东北某猪场新生仔猪出现神经症状，以后肢无力、瘫痪为主要特征，分子诊断和组织病理学结果显示PTV是导致该病的主要原因。我们从发病仔猪的脑组织中分离到一株PTV1型毒株，VP1基因测序结果显示该毒株与现有1型毒株出现进化分歧，表明了PTV1型毒株一直在国内猪群中流行。本研究进而以原核表达的PTVVP1和VP2蛋白为抗原建立间接ELISA方法，结合分子检测方法回顾性调查PTV在临床中的感染情况，并围绕PTV1分离株从单克隆抗体制备、病毒鉴定、分子进化、致病性和传代驯化五个方面开展研究工作。 1.PTV单克隆抗体的制备与间接ELISA方法的建立 以原核表达、纯化的VP1和VP2蛋白为抗原，通过细胞融合、筛选和纯化，分别获得了8株和11株单克隆抗体。WesternBlot（WB）和间接免疫荧光（IFA）试验显示这些抗体能够特异性识别PTV病毒粒子，但所有的VP1和VP2单克隆抗体均不具有中和活性。以原核表达、纯化的VP1和VP2蛋白为抗原建立间接ELISA方法，特异性试验表明两种方法与猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、经典猪瘟病毒（CSFV）、塞内卡谷病毒（SVV）和口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清均无交叉反应，可应用于PTV抗体的检测。 2.PTV1型变异株CHN-NP1-2016的分离鉴定与分子进化特征 将PTV核酸阳性的大脑和小脑组织上清分别接种PK-15（猪肾细胞）、ST（猪睾丸细胞）和Vero（非洲绿猴肾细胞）细胞，经五次连续传代后，我们可以在接种NP1样品的PK-15细胞上观察到变圆、聚集、裂解和部分脱落等细胞病变。基于RT-PCR鉴定、全基因组测序、IFA检测、WB鉴定和病毒粒子电镜观察，证实我们从后肢瘫痪仔猪的脑组织中成功分离到一株捷申病毒，命名为CHN-NP1-2016。经三轮空斑纯化和连续传代后，F15代病毒滴度可以达到106.43TCID50/mL。PTVCHN-NP1-2016在PK-15细胞上空斑形成能力较弱，不能感染Vero、MA-104（罗猴胚胎肾细胞）、BHK-21（仓鼠肾成纤维细胞）、CRFK（猫肾细胞）、MDCK（犬肾细胞）和MDBK（牛肾细胞）细胞，仅能感染PK-15和iPAM（猪肺泡巨噬细胞）等猪源细胞，显示出很强的宿主偏好性。相较于PK-15细胞，CHN-NP1-2016F7代病毒在iPAM细胞上增殖滴度更高，细胞病变效应更明显，具有更强的适应性。CHN-NP1-2016对免疫细胞的偏好性提示猪肺泡巨噬细胞可能是PTV感染宿主的重要靶细胞。 基于病毒P1基因氨基酸序列的系统发育和遗传差异分析确定了PTV分型的临界遗传距离为0.102±0.008。CHN-NP1-2016与现有PTV1毒株之间的遗传距离为0.080±0.008，显著高于PTV1型内部遗传距离（0.056±0.005），表明CHN-NP1-2016属于PTV1型变异毒株。在氨基酸水平，VP1是CHN-NP1-2016变异最大的病毒蛋白，与其他PTV1分离株的同源性仅为89.53±0.38%，其次是VP2，同源性为91.05±0.22%。我们使用RDP软件在P1基因区域发现重组信号，内部和外部重组区域系统发育关系的不一致性表明CHN-NP1-2016属于天然重组毒株。对PTV结构蛋白进行选择压力分析，发现P1基因共有92.25%的氨基酸位点受到负选择作用（798/865），3.82%的位点受到正选择作用（33/865），表明负选择在PTVs进化的过程中起主导作用，而正选择可帮助病毒获得新的免疫特性，呈多样性进化。此外，基于马尔科夫蒙特卡洛贝叶斯框架推断PTVP1基因的平均进化速率为1.11×10-3（95%CI7.33×10-4-1.54×10-3）替换/位点/年，最近共同祖先可追溯到公元796（95%CI128-1293）年，表明PTV是一个古老的病毒，已在猪群中存在一千多年。 3.PTV1型变异株CHN-NP1-2016的致病性 在本研究中，用1×106TCID50和2×106TCID50PTVCHN-NP1-2016分别经口感染4日龄（PTV抗体阴性）和7日龄（PTV抗体阳性）仔猪，结果显示所有感染仔猪出现了共济失调、后肢虚弱无力、后肢瘫痪、阵发性后肢痉挛等临床症状。用5×106TCID50CHN-NP1-2016经口感染24日龄（PTV抗体阳性）断奶仔猪，在整个试验期间仅有3头仔猪出现发热症状，持续4-7天，其余仔猪精神状态和饮食均正常。由此可见，变异株CHN-NP1-2016对4日龄和7日龄仔猪的致病力要强于24日龄仔猪，表明幼龄仔猪对CHN-NP1-2016毒株更易感。组织病理学结果显示，变异株CHN-NP1-2016感染可引起4日龄、7日龄和24日龄仔猪出现非化脓性脑炎，病变主要集中在延髓、脑桥和小脑区域，主要包括弥散的小胶质-淋巴细胞结节、局部区域淋巴细胞血管袖套、神经元坏死和嗜神经现象。组织免疫化学检测证明变异株CHN-NP1-2016不仅可以侵染神经组织，还能够在肠道上皮中复制，具有神经-肠道的双重组织嗜性。然而，并未在仔猪感染试验中观察到腹泻症状，且肠道组织的病理变化不明显，肠绒毛形态正常，提示变异株CHN-NP1-2016感染后定植肠道，可以让仔猪不断向环境中排毒，成为传染源。 4.PTV1型变异株CHN-NP1-2016的传代驯化研究 PTV1变异株CHN-NP1-2016在PK-15细胞上连续传代，当代次达到F120后，毒价稳定在108.5TCID50/mL以上。我们每隔10代对传代病毒基因组进行测序，polyprotein氨基酸序列系统发育分析结果显示F10到F151代次的病毒均在一个进化分支中，呈“梯子状”拓扑结构，表明随着传代次数的增加，传代株的遗传突变不断积累，在F141和F151代次时达到稳定。对比不同代次病毒polyprotein氨基酸序列，共发现15个核苷酸突变，其中11个位点氨基酸发生突变，突变率为0.50%（11/2204），没有出现插入或缺失突变，表明CHN-NP1-2016株的基因组在适应细胞的过程中比较稳定。F7、F80和F151代次病毒7日龄仔猪感染试验表明，随着传代代次的增加，病毒的毒力明显减弱。F80代病毒不引起仔猪出现发热和神经症状，仅在感染后1-4天仔猪的粪便中检测到病毒核酸，而F151代病毒不引起仔猪出现临床症状、病理变化和排毒，对仔猪完全没有致病力。相较于F7代病毒，F151代病毒增殖速度更快，增殖滴度大约是F7代病毒的30倍，具有和F7代病毒相似的与F7、F80、F151感染组血清反应的能力，为PTV疫苗的研制提供了候选毒株。 5.PTV感染的回顾性调查 以仔猪先天性震颤和瘫痪神经疾病为调查对象，对2017年4月至2020年9月采集的645份样品进行PTV和常见仔猪神经症状相关病原检测，结果显示：临床中的重要病原，如CSFV、PRV、PRRSV等均为阴性，而非典型猪瘟病毒（APPV）的检出率为59.84%，显著高于PTV（2.17%），且APPV阳性猪场的数量最多（34/44），远远高于PTV（4/44），表明2017-2020年流行的仔猪先天性神经疾病很可能与APPV更有关。需要注意的是，本研究发现了PTV单独感染的情况，阳性猪场数量占4.55%（2/44），表明PTV的单独感染也可能是部分猪场仔猪先天性神经疾病的主要原因。另一方面，我们还发现PTV与APPV共感染的案例（2/44），提醒我们需要在临床中加强关注PTV和APPV共感染的问题。此外，除了PTV1型经典和变异毒株以外，PTV2型和4型毒株也在新生仔猪中流行，引起神经症状。 对2017年4月至2018年12月期间从湖北、湖南、河南等省份收集的1914份血清样品进行ELISA检测，结果显示PTV的VP1和VP2抗体阳性率分别达到63.90%（1223/1914）和62.64%（1199/1914），表明PTV感染在猪群中普遍存在。值得深思的是，临床上PTV抗体的高阳性率是否意味着保护猪群抵抗PTV感染或促进免疫逃逸毒株的产生，致使PTV病原检出率较低，这需要进一步研究。
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