摘要
植物在生长发育过程中会受到各种外界环境因素的影响，如非生物胁迫和生物胁迫。这些胁迫环境不利于植物的生长发育，甚至会造成严重的经济损失。三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen）是一种我国特有的传统中药材，属于五加科人参属植物，具有多方面的药理作用，且市场需求量较大。但生长过程中极易滋生病虫害，其中以根腐病危害最为严重，是制约三七可持续发展的一大障碍，其中尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）是主要的致病菌之一。MYB转录因子在植物防御反应中发挥着重要的作用，本课题以三七为材料，克隆了三七MYB转录因子PnMYB4、PnMYB6以及PnMYB7基因，并分析了它们的表达特性及在抗病中的功能。 本论文的研究工作及得到的主要结果如下： 1.三七MYB转录因子生物信息学分析。克隆得到3个三七MYB转录因子基因，即PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7。这3个PnMYB基因的碱基数分别是1056bp、1043bp、894bp，蛋白氨基酸数分别是351、347、297，相对分子质量为38788.56Da、37286.50Da、32404.64Da，等电点为8.66、5.09、8.66；从蛋白稳定性上看，三七MYB基因不稳定系数分别为63.65、71.73、74.28，均属于不稳定蛋白；此外，总平均亲水性分别为-0.64、-0.518、-0.477，均是亲水性蛋白；三者的分子式分别为C1673H2659N499O530S17、C1626H2547N463O524S10、C1410H2256N412O440S12；预测了PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7蛋白的二级及三级结构，且编码蛋白均为非跨膜蛋白。PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7基因均有R2R3-MYB结构域。 2.对一年生三七分别进行尖孢镰刀菌侵染和外源水杨酸处理。分析PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7基因在三七中的表达模式。在FO处理0~72h下，PnMYB4随着时间的推移表达量逐渐增高，PnMYB7的表达量在48h时最高，而PnMYB6的表达量在4h时最高，随后降低。在外源SA处理0~72h中，PnMYB4的表达量为先下调后升高，在48h~72h时表达量升高；PnMYB6的表达量升高，在24h时增长幅度较小；PnMYB7表达量则先下调后升高，在24h时表达水平最低，在48h时表达量最高。在FO和SA共同处理0~72h内，PnMYB4的表达量呈现递增趋势，在72h时表达量最高；PnMYB7表达量由低到高，72h时表达量最高；而PnMYB6的表达量4h时最高，随后逐渐降低，但在48h时后，表达量开始上升。 3.明确了PnMYB转录因子的转录激活作用，确定了转录激活结构域。利用酵母双杂交系统，实验结果表明PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7基因具有转录激活活性，转录激活域位于C端。 4.明确了PnMYB的亚细胞定位。pRI101-GFP-PnMYB4以及pRI101-GFP-PnMYB7在烟草叶片细胞的细胞核有表达，说明PnMYB4、PnMYB7定位于细胞核中；而转pRI101-GFP-PnMYB6的烟草在叶片细胞中未观察到明显的绿色荧光。 5.明确了PnMYB在转基因烟草中的功能。在尖孢镰刀菌接种5d后，在实验组表达PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7烟草叶片接种FO附近出现轻微腐烂褐变现象，而对照组转空载体烟草叶片接种FO附近出现更严重的褐变、腐烂情况，并且叶片病斑面积远高于实验组烟草叶片面积。说明PnMYB4、PnMYB6、PnMYB7基因瞬时转化烟草增强了对尖孢镰刀菌的侵染抗性。将融合表达载体pRI101-GFP-PnMYB7转入烟草中，构建转基因烟草株系。qRT-PCR分析结果显示，PnMYB7在转基因烟草中成功表达，并且PnMYB7转基因烟草株系中防卫基因PAL4、WIPK、Definsin、PR1c的转录水平明显提高。 以上实验结果表明，PnMYB4、PnMYB6和PnMYB7作为新的三七MYB基因，转录水平会受尖孢镰刀菌侵染和外源SA处理的诱导。在烟草中瞬时表达PnMYB4、PnMYB6和PnMYB7能增强烟草叶片对尖孢镰刀菌侵染的抗性。其中，PnMYB7基因过表达提高了转基因烟草叶片中PAL4、WIPK、Definsin、PR1c四个防卫基因的表达。因此，作为抗病候选基因，PnMYB7可用于基因工程提高植物的抗病性。本论文的开展有助于在分子水平深入认识三七与尖孢镰刀菌的互作及揭示三七PnMYB转录因子在抗尖孢镰刀菌中的分子机制。
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